1、牙齒的發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括上皮間充質(zhì)相互作用、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生、組織礦化和萌出，在這一過(guò)程中有眾多生物因子參與并互相協(xié)調(diào)構(gòu)成調(diào)控牙齒發(fā)育的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。
　　氯離子通道是生物體內(nèi)一種重要的陰離子通道，它們?cè)诩?xì)胞膜和胞內(nèi)細(xì)胞器質(zhì)膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著特定的生物學(xué)功能。最新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，牙齒組織中有氯離子通道存在，某些氯離子通道基因敲除小鼠模型（CFTR和ClC-5）出現(xiàn)了明顯的牙齒結(jié)構(gòu)和形態(tài)異常。ClC-7是電壓門控氯

2、離子通道家族的一個(gè)成員，在體內(nèi)廣泛存在。研究表明ClC-7與某些骨遺傳性疾病密切相關(guān)，人們?cè)谘芯緾lcn7-/-小鼠的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Clcn7-/-小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性和骨硬化癥等癥狀，并伴有牙齒不萌出的現(xiàn)象，同時(shí)在嬰兒骨硬化患者中也發(fā)現(xiàn)了CLCN7基因的突變型。結(jié)合氯離子通道特別是ClC-7的生理功能和牙胚發(fā)育的自身特點(diǎn)，以及牙齒和骨在組織結(jié)構(gòu)上具有的相似性，我們提出這樣的假設(shè)：ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過(guò)程。
　　本課

3、題采用免疫組織學(xué)、原位雜交、RT-PCR和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行了以下三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)研究：
　　第一部分ClC-7在小鼠牙胚中的表達(dá)研究
　　本部分首先應(yīng)用RT-PCR方法證實(shí)出生1d的小鼠牙胚中有Clcn7的表達(dá)，然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來(lái)確定小鼠牙胚中ClC-7蛋白表達(dá)分布模式和原位雜交的方法觀察Clcn7mRNA在小鼠牙胚中的表達(dá)。ClC-7蛋白和Clcn7mRNA在小鼠鐘狀期牙胚中廣泛表達(dá)。小鼠磨牙牙胚鐘狀早期，內(nèi)釉上皮層細(xì)

4、胞、中間層細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞都有ClC-7陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)釉上皮層呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；小鼠磨牙牙胚鐘狀晚期，ClC-7蛋白和Clcn7mRNA在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中存在陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)在牙乳頭細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明電壓門控氯離子通道ClC-7可能在牙齒發(fā)育過(guò)程中具有一定的調(diào)控作用，可能參與了成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞的生理過(guò)程。
　　第二部分ClC-7在牙齒相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)采用R

5、T-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了Clcn7mRNA和ClC-7蛋白在體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中都有Clcn7mRNA和ClC-7蛋白的表達(dá)，兩種細(xì)胞中Clcn7mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中ClC-7蛋白表達(dá)水平要高于成釉細(xì)胞樣細(xì)胞ClC-7蛋白表達(dá)水平。本部分結(jié)果揭示，成釉細(xì)胞樣細(xì)

6、胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23可以做為進(jìn)一步研究ClC-7參與牙齒發(fā)育調(diào)控機(jī)制的細(xì)胞模型，為今后研究ClC-7在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中的生理作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分ClC-7在牙乳頭細(xì)胞分化中的作用研究
　　本部分采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，體外培養(yǎng)小鼠牙乳頭細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入終濃度為25ng/ml的M-CSF和終濃度為50ng/ml的RANKL誘導(dǎo)48h，對(duì)照組不加任何誘導(dǎo)因子，然后

7、采用免疫熒光染色、原位雜交和RT-PCR的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA表達(dá)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入誘導(dǎo)因子M-CSF和RANKL的牙乳頭細(xì)胞中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組。本部分研究表明，M-CSF和RANKL可以提高ClC-7在牙乳頭細(xì)胞中的表達(dá)水平，可能促進(jìn)了牙乳頭細(xì)胞的分化，但M-CSF和RANKL促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA水平升高的機(jī)制和途徑有待于進(jìn)一