1、脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)hit)基因是1996年Ohta等人用外顯子捕獲法克隆并鑒定出來的第一個普通型脆性位點基因，該基因橫跨脆性位點FRA3B，定位于染色體3p14.2上。經(jīng)細胞生物學、腫瘤分子生物學研究，并通過轉(zhuǎn)基因、基因敲除等技術證實其為一種新的抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在大約70％的人類上皮腫瘤尤其是環(huán)境致癌物誘發(fā)產(chǎn)生的腫瘤中出現(xiàn)Fhit基因缺失、甲基化及Fhit蛋白

2、表達減少。研究認為Fhit通過Fhit-底物復合物產(chǎn)生抑癌作用，但Fhit特異的信號通路及影響腫瘤發(fā)展的作用機制還不清楚。為了研究Fhit在DNA損傷應答中的作用機制以及Fhit所涉及或參與的信號通路，我們利用高通量的基因芯片技術進行了電離輻射前后Fhit所影響的基因的篩選及部分基因的鑒定工作。 本實驗首先利用基因芯片技術將HeLa轉(zhuǎn)染空載體的細胞(HA細胞)與HeLa轉(zhuǎn)染含野生型Fhit基因載體的細胞(3-18細胞)分別進行1

3、0Gy電離輻射，并用不輻射的細胞做對照，共四組細胞用Illumina公司的人類全基因組表達譜芯片Human-6 BeadChip進行分析，每個芯片含有>48，000個來自RefSeq的基因信息。對所得的芯片結果進行了D/C(3-18/HA)、F/E(3-18輻射/HA輻射)、E/C(HA輻射/HA)及F/D(3-18輻射/3-18)差異表達基因的分析。選擇p值<0.05，通過比較D/C、F/E、E/C及F/D分別篩選到了648、2820

4、、2816、2825個差異表達基因。 然后將篩選到的差異基因，通過博奧生物公司的網(wǎng)上芯片數(shù)據(jù)分析軟件，在信號通路和相關系數(shù)(Pvalue)等方面進行了分析，對沒有經(jīng)過電離輻射處理只受Fhit基因影響的一對細胞D/C(3-18/HA)的差異表達基因選擇了CT45-5、IL13RA2、MAGEA1、SPANXB1、MDC1、等上調(diào)基因及SPINK4、SPINK6、IL8等下調(diào)基因進行了進一步的驗證；對經(jīng)電離輻射處理前后Fhit過表達

5、的一對細胞F/D(3-18輻射/3-18)的差異表達基因選擇了CDC2、YWHAG、CCNB1、KPNA2等上調(diào)基因進行了進一步的驗證。 首先是在RNA水平上進行驗證，經(jīng)過RT-PCR的驗證，在所選擇的上調(diào)和下調(diào)基因中除了IGFBP3的RT-PCR結果與芯片結果不符外，其它基因的RT-PCR結果均與芯片結果相符。然后在蛋白水平上進行了驗證，由于篩選到的部分基因沒有商品化的抗體可買或可購買到的抗體效價不能滿足實驗的要求，所以本研究

6、制備了鼠抗CT45-5、MDC1和SPANXB1的多克隆抗體，用EIJISA和免疫印跡檢測抗體的滴度及特異性，結果顯示抗血清效價可達到1：12800，且能夠特異識別原核表達的CT45-5、MDC1和SPANXB1蛋白。利用制備的多克隆抗體，在蛋白水平上對CT45-5和MDC1的表達進行了驗證，實驗結果和芯片結果相符。 本研究通過基因芯片技術對可能受Fhit影響的基因進行了篩選，篩選到了大量的基因，為我們進一步研究Fhit的作用機