1、研究目的：骨質(zhì)疏松是代謝性骨病一個典型的疾病，它的發(fā)病基礎是骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡被打破。CKIP-1是一個近期廣受關注的蛋白，參與機體多項生理活動過程，其中一個重要功能是骨形成的負調(diào)控作用，它通過增強泛素連接酶S mur f1中E3的活性來增強其作用。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有多項分化潛能的細胞，并且是成骨細胞的前體細胞，對它功能的調(diào)控能夠影響其成骨分化，從而影響機體的骨平衡代謝。本研究擬利用CKIP-1基因敲除小鼠模型，分別從大體

2、水平觀察CKIP-1影響小鼠整體骨質(zhì)狀況，細胞水平影響干細胞生物學特性及其成骨功能及分子水平初步探討成骨負調(diào)控作用的機制，以期從骨代謝成骨過程的負調(diào)控蛋白方面，進一步揭示骨代謝的可能過程及機制，為骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病的研究及診療提供實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.通過建立 CKIP-1基因敲除小鼠繁育體系，采用 PCR方法鑒定小鼠基因型，并測定小鼠從出生第二周至成年后的體重尾長增長變化，觀察分析小鼠大體水平發(fā)育情況。<

3、br>　　2.利用Micro-CT、組織學染色等方法，測定WT（CKIP-1+/+）及KO（CKIP-1-/-）型小鼠股骨、椎骨及下頜骨骨質(zhì)影像學相關參數(shù)的差異，觀察其在組織學形態(tài)、結構及CKIP-1蛋白定位及表達情況。
　　3.分離培養(yǎng)WT（CKIP-1+/+）及KO（CKIP-1-/-）小鼠BMSCs，采用流式細胞術檢測表面標記分子表達，多向分化實驗測定成脂、成骨分化能力，證實所培養(yǎng)細胞的來源及性質(zhì)。
　　4.采用MTT

4、及平板克隆實驗，檢測WT及KO小鼠BMSCs增殖能力差異，流式細胞術檢測兩者的細胞周期及凋亡情況，探討CKIP-1缺失是否對干細胞相關的生物學特性產(chǎn)生影響。
　　5.對WT及KO小鼠BMSCs進行成骨、成脂誘導，檢測其成骨及成脂能力差異；檢測兩組細胞堿性磷酸酶活性差異，并利用裸鼠顱骨缺損實驗模型，比較兩者BMSCs聯(lián)合纖維蛋白膠修復裸鼠骨缺損修復成骨能力，應用 Micro-CT檢測新骨形成相對量，HE染色及Masso n三色染色比

5、較其新骨結構差別。
　　6.對WT及KO小鼠BMSCs成骨誘導后，應用實時定量PCR方法及Western Blot方法檢測成骨相關分子在mRNA及蛋白水平表達變化，以研究 CKIP-1影響干細胞成骨發(fā)育可能通過哪些分子產(chǎn)生作用。
　　7.采用Western Blot方法檢測MAPK通路相關蛋白在WT及KO小鼠BMSCs經(jīng)成骨誘導后表達的差異，探討CKIP-1調(diào)控成骨過程中產(chǎn)生變化的通路蛋白，及其磷酸化情況，揭示CKIP-1影

6、響成骨作用的可能機制。
　　結果：
　　1.采用鼠尾粗提法結合PCR擴增進行基因型鑒定，KO型小鼠不表達CKIP-1結構中的3號外顯子，表達人工添加的neo抗性基因。選取同窩同性別的WT（CKIP+/+）及 KO（CKIP-/-）型小鼠用于后續(xù)實驗，品相良好的雜合子進行繁殖。并且，WT及KO小鼠自出生后至成年過程中，其體重和尾長的增長均符合線性規(guī)律，兩組并未體現(xiàn)出差異。
　　2. Micro-CT結果顯示，在股骨及椎骨

7、中，KO小鼠的骨體積分數(shù)及骨小梁數(shù)目均比WT小鼠增多，其特定骨表面面積及骨小梁間隙小于WT組；而在下頜骨中，其上述指標未見顯著差異。WT及KO小鼠股骨、椎骨及下頜骨組織的HE染色顯示，兩者骨質(zhì)在大體結構無明顯差異；免疫熒光染色顯示CKIP-1在椎骨、股骨及下頜骨表達較弱，在牙體組織尤其是牙本質(zhì)中也有表達。K O小鼠各樣本均無CK IP-1表達。
　　3.利用WT及KO小鼠股骨密質(zhì)骨經(jīng)膠原酶消化，成功分離培養(yǎng)了間充質(zhì)干細胞，流式細胞

8、術鑒定其大量表達間充質(zhì)來源細胞表面標記CD90、CD105及sca-1，幾乎不表達造血系來源細胞的CD31和CD45，上述分子在WT組及KO組表達均無顯著差異。經(jīng)成骨成脂誘導后，發(fā)現(xiàn)KO小鼠BMSCs的成骨成脂能立均顯著強于WT組。
　　4. MTT及平板克隆實驗結果顯示，KO小鼠BMSCs增殖更快，其克隆形成能力更強；流式細胞術檢測兩者細胞周期顯示，KO組小鼠細胞的S期細胞數(shù)更多，增殖旺盛；而兩者在凋亡方面無顯著差別。
　

9、　5.經(jīng)成骨誘導后，KO組小鼠BMSCs顯示出更強的體外成骨能力，其茜素紅染色和ALP染色結果均顯著高于WT組；且KO組細胞堿性磷酸酶活性較WT組增強；裸鼠顱骨缺損實驗中，KO組細胞的體內(nèi)修復骨缺損能力強于WT組細胞，形成的類骨質(zhì)更多,且結構更加成熟。
　　6.在轉(zhuǎn)錄水平，成骨誘導后，CKIP-1表達下降，而轉(zhuǎn)錄因子Osterix及Runx2，成骨相關因子ALP、Col、BSP及OCN表達顯著增強，KO組高于WT組。蛋白水平的檢測

10、結果與前述實驗基本符合，成骨誘導后，KO組成骨相關因子表達高于WT組。
　　7.對MAPK通路相關蛋白及其磷酸化水平檢測結果顯示，WT組小鼠表達CKIP-1蛋白，而KO組不表達；經(jīng)成骨誘導后，KO組表達Smurf1低于WT組，而MEKK2表達顯著增強，JNK、p-JNK、p-c-jun、p38及p-p38表達升高。此過程中未見ERK1/2、p-ERK1/2表達。
　　結論：
　　1.鼠尾粗提法結合PCR鑒定小鼠基因型較

11、為準確、簡潔和高效。CKIP-1敲除不影響小鼠的出生及發(fā)育成熟，且小鼠的繁殖遵循孟德爾遺傳定律，此繁育體系可穩(wěn)定遺傳。
　　2. KO型小鼠在大體骨質(zhì)方面，較WT小鼠骨質(zhì)增強，并且在骨組織結構方面顯示出更加優(yōu)化的結構；而在下頜骨中，這種變化并不明顯。CKIP-1在牙本質(zhì)中也有表達，提示其可能與牙齒的形成及結構相關。
　　3. CKIP-1不影響干細胞表面標記分子的表達及干細胞的凋亡；而可以抑制干細胞的克隆形成能力和增殖速率。