1、基因控制技術(shù)是森林有害生物綜合治理(IPM)控制策略的核心技術(shù)之一，發(fā)現(xiàn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的功能基因是實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，巰基蛋白酶抑制劑(Cysteineproteinaseinhibtor，CPI)是一類廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)的一個(gè)超級(jí)族，由于CPI能夠有效地抑制昆蟲(chóng)中腸的巰基蛋白酶的水解作用而達(dá)到殺蟲(chóng)的目的，因此，巰基蛋白酶抑制劑已被廣泛地應(yīng)用于抗蟲(chóng)基因工程中。天牛類害蟲(chóng)作為我國(guó)林業(yè)上重大的森林有害生物，危害極其嚴(yán)重。天

2、牛屬于鞘翅目害蟲(chóng)，主要利用消化道內(nèi)的巰基蛋白酶來(lái)進(jìn)行消化，所以分離和克隆植物巰基蛋白酶抑制劑(Phytocystatins，PhyCys)基因并將其應(yīng)用到天牛的抗蟲(chóng)基因工程中，將是一種有效的控制天牛措施。本研究選用我國(guó)抗天牛的鄉(xiāng)土樹(shù)種河北楊為研究對(duì)象，首次應(yīng)用RT-PCR方法從河北楊形成層中分離和克隆了CPI基因，通過(guò)真核表達(dá)載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了經(jīng)親和層析和Western方法檢測(cè)的真核表達(dá)重組蛋白，在此基礎(chǔ)上對(duì)該基因進(jìn)行了抗蟲(chóng)性

3、的功能鑒定，主要研究結(jié)果如下： 1.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從河北楊形成層中分離和克隆了CPIcDNA編碼區(qū)段。序列分析表明該基因編碼區(qū)長(zhǎng)為710bp，包括一個(gè)429bp完整的開(kāi)放閱讀框，編碼143個(gè)氨基酸殘基，此序列具有典型的植物巰基蛋白酶抑制劑的保守序列。在此基礎(chǔ)上，為獲得更長(zhǎng)的CPIcDNA，本研究應(yīng)用了RT-PCR的方法獲得了759bp的3’端河北楊CPIcDNA。 2.分析和預(yù)測(cè)了河北楊CPIcDNA基因所編碼的蛋

4、白質(zhì)的相關(guān)特性。表明河北楊CPI是一種酸性(pI6.51)的小分子量的多肽(15-20KDa)；親/疏水性、蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)和保守區(qū)段、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)域和結(jié)構(gòu)功能域分析表明：該基因所編碼的蛋白具有一個(gè)疏水性區(qū)域和信號(hào)肽區(qū)域(MISSSFISPLLTLAVVLTVTITPLISA)，具有典型的cystatins保守區(qū)段和蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)(EQVVAGTMHHLTIE)，屬于一種細(xì)胞外蛋白并具有一個(gè)跨膜區(qū)域(LLTLAVVLAVTITPLI

5、SASGGFC)，蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析表明，河北楊CPI也屬于一種單結(jié)構(gòu)域(GGVHDSQSSQNSAEIDSLARFAV)的小分子多肽。 3.應(yīng)用PCR方法獲得了795bp的河北楊CPI基因，其基因中包含一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子，具有典型的GT/AG法則。其啟動(dòng)子序列從上游第4個(gè)堿基-到第54個(gè)堿基，是一種來(lái)自于林木上的單結(jié)構(gòu)域的植物CPI，不能歸于Margis所進(jìn)行的分類范疇，屬于一種新的植物CPI。 4.應(yīng)用CLUST

6、AL(1.83)軟件比對(duì)了河北楊與其它43種植物CPI的氨基酸序列同源性，結(jié)果表明，河北楊和大多數(shù)植物CPI具有相同的保守區(qū)域，說(shuō)明了河北楊CPI在進(jìn)化上比較保守；應(yīng)用MEGA3.1對(duì)上述植物CPI的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，植物CPI可以大致分為三大類群，其中第一類群包括絕大部分的植物CPI，第一類群并可繼續(xù)分為三個(gè)亞類，河北楊CPI主要屬于第一類型中的第一亞類，系統(tǒng)發(fā)育分析也說(shuō)明，植物CPI在植物體內(nèi)表現(xiàn)出超家族和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)。

7、5.構(gòu)建了帶BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的河北楊CPI的真核表達(dá)質(zhì)粒pYEX4T-2，通過(guò)酵母菌的轉(zhuǎn)化和硫酸銅不同時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析后獲得了大約20KDa單一的重組蛋白，SDS-PAGE和Western方法檢測(cè)證明了重組蛋白就是河北楊CPI基因在真核表達(dá)載體中高效表達(dá)的特異性蛋白，這也是國(guó)內(nèi)首次通過(guò)真核表達(dá)載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)植物CPI的方法，為鑒定基因的功能提供了蛋白資源。 6.將上述獲得的重組蛋白與不同量的飼料混合，

8、通過(guò)對(duì)2-3齡松墨天牛室內(nèi)飼喂試驗(yàn)研究表明：不同含量的重組蛋白對(duì)松墨天牛的生長(zhǎng)發(fā)育影響不同。當(dāng)飼料中重組蛋白的含量較低時(shí)(0.0125mg/g)時(shí)，松墨天牛的生長(zhǎng)和發(fā)育受到明顯的抑制，當(dāng)重組蛋白的含量越來(lái)越高時(shí)(0.025-0.2mg/g)，其殺蟲(chóng)效果越好，松墨天牛死亡也越早(2d)，死亡率也越高(100％)；與此同時(shí)，天牛的活動(dòng)能力與飼料中的重組蛋白的含量呈明顯的相關(guān)性，重組蛋白的濃度越高，天牛取食后活動(dòng)能力越差；接近死亡時(shí)，天牛的形