1、惡性黑素瘤（Malignant Melanoma）是皮膚腫瘤的一種，90％來(lái)自于表皮的黑素細(xì)胞惡變，多由痣或色素斑發(fā)展而來(lái)。一旦進(jìn)入進(jìn)展期，則預(yù)后差、死亡率高，在致死性的皮膚惡性腫瘤中達(dá)到80％的比例。黑素瘤是所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤，年增長(zhǎng)率約3-5％，白色人種發(fā)病率高于其他膚色人種，中國(guó)等發(fā)病率較低的地區(qū)，近年來(lái)發(fā)病率增長(zhǎng)迅猛，目前部分地區(qū)（北京和上海）的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)顯示已達(dá)到1/10萬(wàn)，發(fā)病年齡也趨于年輕化。黑素瘤具有惡性

2、程度高、進(jìn)展快、早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移且對(duì)放、化療均不敏感等特點(diǎn)。近年來(lái)，針對(duì)進(jìn)展期黑素瘤進(jìn)行了大量的免疫治療的研究，通過(guò)腫瘤疫苗和免疫細(xì)胞過(guò)繼等治療促進(jìn)體內(nèi)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量增加，體外實(shí)驗(yàn)表明腫瘤抗原特異性T細(xì)胞可以攻擊并破壞腫瘤細(xì)胞，但臨床上出現(xiàn)腫瘤消退的患者很少。也有研究表明在黑素瘤腫瘤組織中存在活化的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞，但不能有效破壞腫瘤細(xì)胞。由此現(xiàn)象，人們認(rèn)識(shí)到黑素瘤腫瘤微環(huán)境中存在免疫耐受機(jī)制，其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T

3、細(xì)胞（Treg）的存在是介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境免疫耐受的重要因素。
　　機(jī)體免疫系統(tǒng)受多重調(diào)節(jié)，其中Treg發(fā)揮著重要免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞以維持免疫耐受，同時(shí)也抑制了腫瘤抗原特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮有效的抗腫瘤應(yīng)答。Treg通過(guò)細(xì)胞接觸和分泌TGF-β和IL-10等免疫抑制性細(xì)胞因子等方式發(fā)揮免疫抑制功能。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤組織中存在Treg，黑素瘤腫瘤組織中Treg的數(shù)量與患者的預(yù)后及生存率明顯負(fù)相關(guān)，通過(guò)清除或抑制Tr

4、eg可明顯促進(jìn)腫瘤的消退和提高生存率，也可顯著提高腫瘤疫苗和細(xì)胞過(guò)繼免疫等治療的效果。
　　目前研究顯示Foxp3（Transcription factor forkhead box protein 3）分子是Treg唯一的標(biāo)志性分子，對(duì)于Treg的發(fā)育和功能維持發(fā)揮重要的“總開(kāi)關(guān)”的作用。小鼠和人的Foxp3基因突變，可引起Treg缺失，導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫紊亂，異位表達(dá)Foxp3分子可使CD4+CD25-T細(xì)胞獲得全部或部分Tr

5、eg的表型和功能。Foxp3分子的表達(dá)曾被認(rèn)為嚴(yán)格限制于T細(xì)胞系，近來(lái)有研究報(bào)告Foxp3也表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞，并使胰腺癌細(xì)胞獲得部分Treg的表型和功能。我們推斷Foxp3分子也有可能表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞，參與維持黑素瘤腫瘤微環(huán)境的免疫耐受。
　　我們?yōu)轵?yàn)證該假設(shè)進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。目的：證實(shí)Foxp3分子是否表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞，是否能夠抑制功能性T細(xì)胞的增殖和功能，明確其是否參與維持黑素瘤腫瘤微環(huán)境的免疫耐受狀態(tài)、逃逸機(jī)體免疫攻擊。方法：

6、通過(guò)RT-PCR檢測(cè)黑素瘤細(xì)胞系中Foxp3的mRNA轉(zhuǎn)錄，通過(guò)Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑素瘤細(xì)胞系中Foxp3分子的表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)Foxp3分子在黑素瘤細(xì)胞內(nèi)的定位；通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Foxp3在黑素瘤組織中的表達(dá)、定位及其表達(dá)與Ki67之間的關(guān)系；對(duì)比研究干擾、過(guò)表達(dá)Foxp3后黑素瘤細(xì)胞的自身生物學(xué)特點(diǎn)的變化，同時(shí)檢測(cè)黑素瘤細(xì)胞免疫抑制相關(guān)分子表達(dá)量的變化、對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：證實(shí)在黑素瘤

7、細(xì)胞存在Foxp3的mRNA轉(zhuǎn)錄和分子表達(dá)，而作為對(duì)照的黑素細(xì)胞未檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)，激光共聚焦顯示Foxp3分子定位于黑素瘤細(xì)胞的胞核和核周部位。黑素瘤組織病理切片的免疫組織化學(xué)證實(shí)Foxp3表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞的胞核和核周、浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的胞核，皮內(nèi)痣的黑素細(xì)胞未檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)；連續(xù)切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果分析顯示Foxp3的表達(dá)與Ki67的表達(dá)正相關(guān)。過(guò)表達(dá)Foxp3的黑素瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)胞核分葉增多、突觸回縮、胞內(nèi)吞噬泡樣

8、結(jié)構(gòu)增多，增殖速度減慢，而干擾組細(xì)胞此變化不明顯；過(guò)表達(dá)組和干擾組的細(xì)胞周期分析和凋亡檢測(cè)顯示無(wú)明顯差異；過(guò)表達(dá)組免疫抑制相關(guān)分子B7-H1和TGF-β家族分子的表達(dá)上調(diào)，與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示黑素瘤細(xì)胞對(duì)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用較正常對(duì)照組增強(qiáng)，而干擾組與之相反。結(jié)論：黑素瘤細(xì)胞系及黑素瘤組織中的黑素瘤細(xì)胞普遍存在Foxp3的表達(dá)，而原代培養(yǎng)的和皮內(nèi)痣組織中的黑素細(xì)胞未檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)；黑素瘤細(xì)胞中的F

9、oxp3的表達(dá)與Ki67的表達(dá)明顯正相關(guān)；干擾、過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示黑素瘤細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)量與部分免疫抑制相關(guān)分子的表達(dá)量以及抑制外周血淋巴細(xì)胞增殖的能力正相關(guān)。
　　綜上所述，我們認(rèn)為黑素瘤細(xì)胞表達(dá)Foxp3是黑素瘤腫瘤微環(huán)境抑制免疫系統(tǒng)、逃逸免疫攻擊的一種新機(jī)制。本課題證實(shí)了黑素瘤細(xì)胞表達(dá)Foxp3，F(xiàn)oxp3的表達(dá)與黑素瘤細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞的功能相關(guān)，但其發(fā)揮免疫抑制功能的具體機(jī)制還需要深入研究。Foxp3在黑素瘤細(xì)胞中作用機(jī)