1、目的：目前,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NGF對(duì)雪旺細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。同時(shí),在雪旺細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有NF-KB的表達(dá)。現(xiàn)已明確NF-KB的表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有抗凋亡、促增殖的效果。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此就NGF促進(jìn)SCs的增殖及其與NF-KB的表達(dá)上調(diào)是否存在某種關(guān)系進(jìn)行了研究.旨在為進(jìn)一步明確雪旺細(xì)胞增殖的機(jī)制提供相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　方法：選擇健康家兔十只,給予5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉,無(wú)菌條件下取出坐骨神經(jīng),分離培養(yǎng)出雪旺細(xì)胞,并進(jìn)行S-10

2、0免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,以鑒定細(xì)胞純度,將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/ml后,接種到預(yù)涂有鼠尾膠的三個(gè)培養(yǎng)皿,分別計(jì)為實(shí)驗(yàn)組(加入40ng/ml的NGF);阻斷組(加入40ng/ml的NGF和anti-NGFR);對(duì)照組(加入等量PBS)。置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,熒光顯微鏡下觀察S-100熒光標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)數(shù),提取RNA及蛋白進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),每組應(yīng)進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：接種后的第24h開(kāi)始,

3、可以倒置顯微鏡下觀察到貼壁生長(zhǎng)的具有明顯形態(tài)的雪旺細(xì)胞,鏡下觀察所有分組的細(xì)胞都包含兩類,雪旺細(xì)胞胞核為長(zhǎng)形或圓形;胞體為立體感強(qiáng)、非常飽滿的梭形體,兩端有細(xì)長(zhǎng)的突起,胞體周圍長(zhǎng)有亮帶,即生長(zhǎng)暈,細(xì)胞數(shù)量占絕大多數(shù)。另一種細(xì)胞即成纖維細(xì)胞,胞核很淺,具2~3個(gè)核仁,胞體扁平、大且不規(guī)則,常常出現(xiàn)多而短的突起,數(shù)量較少。所有分組的雪旺細(xì)胞均呈“端端相對(duì),極極相對(duì)”等旋渦排列或網(wǎng)狀排列,逐漸形成片狀,有如“地毯”。S-100免疫組化檢測(cè)鑒定

4、,對(duì)胞漿為棕褐色的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果為:本研究體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞純度達(dá)到了91%。OD值結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中,雪旺細(xì)胞24~72h增殖速率明顯加強(qiáng),72h后增殖依然強(qiáng)勁,至第5d達(dá)到峰值,最后漸漸緩慢下降;期間與對(duì)照組在每一時(shí)間節(jié)點(diǎn)均出現(xiàn)顯著差異。自CLSM上進(jìn)行圖像采集顯示:阻斷組和實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞的NF-KB綠色熒光同樣多出現(xiàn)于胞漿區(qū);實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)度較正常組顯著提高,而阻斷組與對(duì)照組無(wú)明顯差別。經(jīng)LeiCaConfoeal圖像分析軟件分

5、析,結(jié)果顯示:阻斷組與實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)顯著差異(p<0.01),而對(duì)照組與阻斷組組無(wú)顯著差異(p>0.05)。對(duì)照組、阻斷組、實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞中NF-KBmRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組、阻斷組出現(xiàn)顯著增高,而阻斷組和對(duì)照組相比,無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：1.采用組織貼塊法、差速貼壁法與低濃度胰蛋白酶消化法、G-418相結(jié)合的純化形式,可以建立良好的家兔坐骨神經(jīng)SCs原代培養(yǎng)模型。
　　2.添加40ng/L的外源

6、性NGF可以顯著提高SCs的增殖速率,同時(shí)NF-KB表達(dá)明顯上調(diào)。添加NGF+anti-NGFR組的SCs細(xì)胞增殖速率和NF-KB的表達(dá)水平都與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別.由此可以說(shuō)明NGF是通過(guò)與P75結(jié)合來(lái)促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和提高NF-KB表達(dá)水平的。
　　3.NF-KB表達(dá)在SCs增殖過(guò)程中表達(dá)上調(diào),且增殖最快的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)上調(diào)的最高,且大量實(shí)驗(yàn)研究表明NF-KB的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。所以推測(cè)NF-KB的高表達(dá)對(duì)雪旺