1、1.研究背景與目的：
　　生物節(jié)律性對生物體的行為學和生理學的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，越來越多的證據(jù)已經(jīng)證實，生物節(jié)律性紊亂可以提高致癌風險。輪班制工作，飛行時差反應(yīng)，夜間光污染等均被列為引起生物節(jié)律性紊亂的因素。此外，生物節(jié)律性是否正常也可以作為一個獨立影響因子，對癌癥患者的預(yù)后具有預(yù)測性?；谏鲜鲆罁?jù)，有學者提出時間療法這一概念。由于癌癥細胞與正常體細胞表現(xiàn)出不同的生物節(jié)律性，所以時間療法即是利用這種差異，而給癌癥患者安排藥物

2、或物理治療時間的方法。而這一療法在癌癥綜合治療及個性化治療中具有較好的應(yīng)用前景已被眾多研究證實。然而，生物鐘紊亂對口腔相關(guān)疾病影響的研究尚較少。
　　近年來，PFKFB3及其產(chǎn)物iPFK2備受關(guān)注，因為其被證實為PFKFB家族中作用最強的激酶。iPFK2可以通過促進PFK1，這一糖酵解限速酶的功能，從而大大提高糖酵解反應(yīng)的速率。而早在1927年，學者Otto Warburg即研究證實，即使在供氧充足的條件下，癌癥細胞生物代謝所需能

3、量的80％仍來源于無氧代謝——糖酵解過程，此經(jīng)典供能模式被稱為“Warburg效應(yīng)”。同時，大量臨床證據(jù)已證實，PFKFB3在眾多癌癥組織中都呈現(xiàn)出高表達。針對PFKFB3研發(fā)出的小分子抑制劑3PO已被作為單一靶向治療藥物正式進入臨床試驗階段。可見，PFKFB3在癌癥細胞能量代謝中扮演著極其重要的角色。
　　然而，目前為止，并無相關(guān)研究探究生物節(jié)律性的紊亂或者PFKFB3本身的生物節(jié)律性是否會影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展。如果能夠找出PF

4、KFB3的生物節(jié)律性與口腔癌癥之間的相互作用，并PFKFB3為藥物靶點，將時間療法應(yīng)用于口腔癌癥的治療中，無疑是為口腔癌癥的綜合治療及個性化治療提供了一個全新的思路。
　　2.研究材料與方法：
　　（1）將購買獲得的人舌癌細胞系SCC9增殖培養(yǎng)后，采用血清饑餓處理的方法同步化，分6個時間點分別收集細胞，裂解后提取細胞的 RNA，采用RT-PCR的方法探索該細胞PFKFB3，CLOCK，Bmal1，Per1以及Per2的生物節(jié)

5、律性；
　　（2）采用基因測序的方法獲得PFKFB3啟動子全序列，并利用軟件定位出啟動子上所有 E-boxes的位置；利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告檢測技術(shù)證實CLOCK、Bmal1及其復合物對PFKFB3表達的調(diào)控機制，及在不同時間點下PFKFB3的表達差異；
　　（3）以SCC9為細胞模型，以3PO為PFKFB3的靶向抑制劑，利用RT-PCR、細胞流式等技術(shù)，體外證實不同時間點下，3PO抑制PFKFB3表達的能力是否有所差異

6、，以及時間療法對細胞生物行為的影響。
　　3.研究結(jié)果：
　　（1） PFKFB3基因在舌癌細胞中表達具有明顯的生物節(jié)律性，具有早晨表達被促進，夜間表達被抑制的規(guī)律。生物鐘核心正反饋基因CLOCK在舌癌細胞表達的生物節(jié)律性與PFKFB3基因極其相似；而生物鐘核心正反饋基因Bmal1表達紊亂，持續(xù)被抑制在極低水平；生物鐘核心負反饋基因 Per1及Per2在舌癌細胞中表達的生物節(jié)律性具有雙高峰；
　?。?） PFKFB3啟

7、動子上有33個E-box，其中包括一個嚴格的Bmal1/CLOCK復合體結(jié)合位點（CACGTGA），同時證實，CLOCK/Bmal1復合體對PFKFB3轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控規(guī)律為：增加CLOCK的表達，可顯著提高PFKFB3基因的轉(zhuǎn)錄水平；而這種作用會被Bmal1抑制；將CLOCK變異后，PFKFB3基因的表達幾乎接近正常細胞水平；因此PFKFB3基因的節(jié)律性表達中，CLOCK起的作用更為關(guān)鍵；
　?。?）體外不同時間點給予舌癌細胞PF

8、KFB3抑制劑3PO刺激，ZT7時癌細胞的增殖能力可被顯著抑制，凋亡能力可被顯著促進；而ZT19這一時間點下，藥物效果無顯著差異；同時，在兩個時間點下，PFKFB3抑制劑3PO對舌癌細胞的細胞周期均無明顯的影響。
　　4.研究結(jié)論：
　　本研究首次從細胞的基因水平證實，PFKFB3在舌癌細胞中不僅表達量增高，而且具有生物節(jié)律性，這一生物節(jié)律性極有可能受到 CLOCK/Bmal1復合體的直接調(diào)控，其中 CLOCK可能占有更為主