1、microRNAs(miRNAs)是一類大小約為18-23 nt的小分子非編碼RNA，其發(fā)現(xiàn)被譽為2002年世界十大科技突破之首。miRNAs由具有發(fā)夾結構的70～90個堿基大小的單鏈miRNA前體（pre-miRNA）經(jīng)Dicer加工產(chǎn)生而成，廣泛存在于生物界中，自第一個miRNA分子在線蟲中發(fā)現(xiàn)后，在動物、植物以及病毒中已經(jīng)有24521個miRNAs分子被鑒定，在人體中miRNAs的種類也超過了2200種。
　　miRNAs以

2、單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，而且絕大部分定位于基因間隔區(qū)，其轉錄獨立于其他的編碼基因，并不參與蛋白質(zhì)的翻譯。miRNA主要通過降解靶mRNAs或抑制靶mRNAs編碼蛋白質(zhì)的翻譯，從而沉默特定的靶基因，從而發(fā)揮生物學作用;某些miRNAs還能改變相應mRNAs的半衰期來調(diào)控基因的表達。miRNAs的序列也不是任意的，在很大的進化距離中具有保守性。通過生物信息學手段可以發(fā)現(xiàn)，人類約有1/3以上的蛋白編碼基因受到miRNA

3、s的調(diào)節(jié)。miRNAs通過調(diào)節(jié)目的蛋白的表達，在生物體的早期發(fā)育、信號傳導、細胞死亡，細胞凋亡、細胞增殖等生理和病理過程中都發(fā)揮著重要的作用。
　　單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus-1，HSV-1）感染眼部所引起的單純皰疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK）可導致角膜溶解、新生血管形成、潰瘍穿孔乃至全眼球炎等嚴重的病理改變。本病復發(fā)率高且嚴重損害視功能，是全球致盲率第一

4、位的角膜病變1-3。盡管迄今為止，關于HSK的研究取得了一定的進展，對于這種疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸及防治有了一定程度上的認識。但在這些領域還有很多未知的空白有待填補。越來越多的證據(jù)表明:miRNAs作為機體內(nèi)各種生理及病理活動的關鍵調(diào)節(jié)因子，參與了固有免疫應答及適應性免疫應答。就宿主與病毒而言，miRNAs的調(diào)控既參與了宿主對自身的保護機制和對病毒的抑制，又參與了病原體對抗宿主免疫過程。那么，HSV-1感染引起HSK炎癥反應早期是否影響

5、了角膜組織miRNAs的表達？miRNAs是否參與HSK的炎癥反應？作用機制又如何？上述問題目前國外研究尚少，國內(nèi)均未見系統(tǒng)報道。
　　有鑒于此，我們首先以HSV-1感染小鼠角膜，建立HSK炎癥反應模型，并以此為研究對象，利用基因芯片等技術系統(tǒng)分析了HSV-1感染后角膜組織miRNA表達譜的改變情況，并且利用生物信息學技術分析差異miRNAs的作用;在此基礎上，我們對表達變化最為明顯的miRNA-155在HSK炎癥反應中促炎作用的

6、分子機制展開研究，評價了miRNA-155對HSK臨床表現(xiàn)的影響。本課題擬通過對以上科學問題的探討，一定程度上闡明HSK炎癥反應的的非編碼RNA機制，為后續(xù)的疾病治療及藥物開發(fā)提供理論和實驗基礎。
　　第一部分 HSV-1感染引起角膜組織microRNA表達譜變化及功能分析
　　目的:
　　(1)運用miRNA芯片法檢測HSV-1感染后導致的HSK小鼠角膜組織與正常小鼠角膜組織的miRNA表達譜變化，初步篩選出差異mi

7、RNAs。
　　(2)將芯片結果進行生物學驗證，運用qRT-PCR確定HSK與正常小鼠角膜組織中表達差異的miRNAs。
　　(3)運用生物信息學技術預測差異miRNAs的靶基因，分析差異靶基因的功能，構建MicroRNA-GO-Network，研究miRNAs調(diào)節(jié)的主要生物學功能，討論其在HSK發(fā)病過程中的作用。
　　方法:
　　(1) C57BL/6小鼠共40只，構建小鼠HSK動物模型，隨機分為2組:對照組2

8、0只，僅對該組小鼠行角膜“十”字劃傷，接種病毒培養(yǎng)液;實驗組20只，該組小鼠在給予“十”字劃傷后，將Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)滴入結膜囊，按摩30s。劃傷眼每日以0.5％慶大霉素眼液滴眼建立小鼠HSK模型。
　　(2)獲取實驗組與對照組小鼠角膜組織，利用Affymetrix miRNA3.0芯片分析二者miRNA表達譜系的差異，找出表達水平顯著改變的miRNAs。
　　(3)選取芯片結果中差異性表達明顯（上調(diào)或下調(diào)超過2

9、倍）的成熟miRNAs，運用qRT-PCR技術對miRNA芯片結果進行驗證，確定HSK角膜組織中差異表達的miRNAs。
　　(4)生物信息學技術預測差異miRNAs的靶基因，構建靶基因功能網(wǎng)絡，確定差異miRNAs與炎癥反應相關的主要功能。
　　結果:
　　(1)裂隙燈觀察術后小鼠，術后7天小鼠明顯發(fā)病，角膜上皮見上皮完整性破壞，角膜混濁明顯，新生血管形成。可見小鼠角膜“十”字劃痕法建立的HSK的模型有很好的可操作性

10、和重復性，模型成功率為90％，可以用于miRNA表達譜變化的研究。
　　(2)基因芯片結果顯示，共有34個miRNA出現(xiàn)差異性表達:mmu-miRs-5100，-21-3p,-133a-3p,-18a-5p,-150-5p,-155-5p,-133b-3p,-139-5p,-146a-5p,-206-3p,-124-3p,-300-3p,-5115,-5097,-1224-5p,-720,-712-5p,-342-3p,-223-

11、3p,-714,-17-3p,-1934-3p,-204-5p,-3968,-21-5p,-3096b-5p,-200a-3p,-204-3p,-148a-3p，-181c-5p，-346-3p，-434-3p，-711，-762。其中15個miRNA出現(xiàn)差異性表達在2倍以上，其中mmu-miRs-223-3p，-155-5p，-21-3p，-150-5p，-18a-5p，-3096b-5p，-146a-5p，and-342-3p表達上

12、調(diào);mmu-miRs-434-3p，-124-3p，-204-5p，-133b-3p，-206-3p，and-133a-3p表達下調(diào)。
　　(3) qRT-PCR證實，miRs-204-5p,-206-3p,-155-5p,-133a-3p,and-150-5p在HSK角膜組織中有明顯差異性表達。
　　(4)上述5個miRNAs共有125潛在靶點。92個上調(diào)的基因受到mmu-miRs-204-5p，-206-3p，及-133

13、a-3p三個下調(diào)基因的調(diào)控;33個下調(diào)基因受到mmu-miRs-155-5p及-150-5p兩個上調(diào)基因的調(diào)控。
　　(5) miRNAs靶基因網(wǎng)絡及功能分析顯示，5種差異miRNAs靶基因共同具有的與炎癥反應密切相關的功能為細胞增殖的負調(diào)控及細胞黏附。
　　結論:
　　(1)角膜“十”字劃痕法建立的HSK的小鼠模型有很好的可操作性和重復性，可以用于miRNAs表達譜差異的研究。
　　(2) miRNA芯片顯示H

14、SV-1感染造成的HSK角膜組織與對照組角膜組織中miRNAs表達譜有明顯差異，34種miRNAs出現(xiàn)了表達變化。
　　(3) qRT-PCR證實5種miRNA在HSK角膜組織中有明顯差異性表達，差異的趨勢與芯片結果相同。
　　(4)表達差異的miRNA有多達125個潛在靶點。靶基因的共同的主要功能中，細胞增殖的負調(diào)控及細胞黏附，與炎癥反應高度相關
　　第二部分 microRNA-155對單純皰疹病毒性角膜炎炎癥反應調(diào)

15、控作用初探
　　目的:
　　(1)探索miRNA-155局部在體下調(diào)小鼠模型的建立方法。
　　(2)探討miRNA-155影響小鼠HSK炎癥反應程度的分子學機制。
　　(3)探索miRNA-155局部下調(diào)對小鼠HSK角膜炎癥反應臨床表現(xiàn)的影響。
　　方法:
　　(1) C57BL/6小鼠共30只，組1右眼前房內(nèi)注射慢病毒，左眼注射等量NS;組2右眼角膜上皮劃傷，載體慢病毒液浸潤，左眼同樣方法以NS對照

16、;組3右眼前房注射空質(zhì)粒病毒載體，左眼刮傷上皮，浸潤等量空質(zhì)粒病毒載體。建模后第3、5、7天裂隙燈下觀察GFP于角膜部位的表達。于第7天取角膜，切片后熒光顯微鏡下觀察GFP表達。
　　(2) C57BL/6小鼠50只，10只“十”字劃傷建立HSK模型，20只“十”字劃傷建立HSK模型后角膜上皮劃傷慢病毒浸潤法轉染miRNA-155下調(diào)質(zhì)粒，構建miRNA-155局部下調(diào)HSK小鼠模型，20只同樣方法建立陰性對照質(zhì)粒轉染HSK小鼠模

17、型。建模后7天，選取GFP表達占角膜面積20％以上的HSK小鼠角膜，qRT-PCR法檢測IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17，IFN-γ，TNF-α，CXCL1的表達水平
　　(3) C57BL/6小鼠50只，按照上述方法建立HSK小鼠10只、miRNA-155下調(diào)HSK及陰性對照質(zhì)粒轉染HSK模型各20只。建模后7天，選取GFP角膜表達占角膜面積20％以上的HSK小鼠，雙盲法采用Heiligenhaus等[1]

18、及Foster等[2]介紹的標準對小鼠HSK臨床表現(xiàn)進行評估。
　　結果:
　　(1)裂隙燈觀察角膜劃傷后局部浸潤慢病毒的小鼠角膜，術后3天可見明顯GFP表達，5天表達增多;7天時GFP面積最大，強度增強;前房注射法未見GFP熒光表達。熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒主要感染部位為角膜上皮及淺基質(zhì)可以用于miRNA下調(diào)的研究。
　　(2) qRT-PCR結果顯示，HSK組，miRNA-155下調(diào)HSK，及空質(zhì)粒轉染HSK組IL

19、-17及CXCL1表達差異有明顯統(tǒng)計學意義。
　　(3)臨床表現(xiàn)評分顯示，HSK組，miRNA-155下調(diào)HSK，及空質(zhì)粒轉染HSK組于感染后3天，5天及7天角膜上皮損傷，角膜混濁及新生血管程度差異均無明顯統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　(1)角膜局部劃傷慢病毒浸潤后，載體可轉染小鼠角膜上皮及淺基質(zhì)層，有較好的可操作性，可以用于miRNA功能的研究。
　　(2) miRNA-155下調(diào)可減少角膜IL-17及CXCL