1、補(bǔ)體(complement)系統(tǒng)作為天然免疫(innate immunity)中的一類重要和保守的體系，當(dāng)病原微生物或炎癥介質(zhì)存在時(shí)可被激活最終通過末端成分組裝成C5b-9膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，為機(jī)體提供了快速和高效的清除入侵微生物的途徑。MAC是一種多效免疫因子，在補(bǔ)體大量活化后，可插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶破死亡，而近年來通過對MAC與有核細(xì)胞相互作用的研究，這一觀點(diǎn)已發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)證明：

2、有核細(xì)胞能通過囊泡化或內(nèi)吞作用，清除沉積于細(xì)胞膜上的MAC，保護(hù)自身免遭補(bǔ)體溶破，此時(shí)的MAC稱為亞溶破MAC(sublytic MAC，sMAC)。體外的研究也證實(shí)，亞溶破劑量的MAC對多種有核細(xì)胞具有刺激和活化作用。近來新的研究發(fā)現(xiàn)，非致死劑量的MAC可沉積于中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞等多種有核細(xì)胞，刺激細(xì)胞發(fā)生多種代謝改變，包括分泌氧自由基、類脂質(zhì)等炎癥介質(zhì)，并誘導(dǎo)細(xì)胞因子、黏附分子以及其他功能蛋白的表達(dá)等。補(bǔ)體系統(tǒng)除了補(bǔ)體的直接殺傷機(jī)

3、制外，在補(bǔ)體活化過程中釋放的多種小片斷分子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括趨化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、調(diào)理吞噬、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等等。因此，補(bǔ)體是連接機(jī)體天然免疫和獲得性免疫(adaptive immunity)的“橋梁”。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)，能高效的攝取、加工處理和提呈抗原，具有較強(qiáng)的遷移能力，并能顯著

4、地激活初始型T細(xì)胞以啟動T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中處于中心調(diào)控地位。此外，DC與B細(xì)胞以及NK細(xì)胞等也存在著相互作用，可見，DC在連接天然免疫和獲得性免疫之間起著非常重要的作用。DC是一類異質(zhì)性的細(xì)胞群體，不同的亞群，不同的成熟狀態(tài)，其免疫學(xué)功能特點(diǎn)不同，在免疫應(yīng)答與免疫耐受、抗腫瘤、抗感染免疫中發(fā)揮不同的作用。多種外源或內(nèi)源因素均可調(diào)節(jié)：DC的分化發(fā)育，刺激其成熟以及免疫學(xué)功能。但到目前為止，還未見補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9與樹突

5、狀細(xì)胞相互作用，特別是補(bǔ)體C5b-9是否影響樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育成熟已經(jīng)免疫學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道。 有研究顯示，血液中樹突狀細(xì)胞表面有補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9沉積，甚至在培養(yǎng)幾天后還能檢測到，且樹突狀細(xì)胞的活力也未受影響，在人的濾泡樹突狀細(xì)胞所處的淋巴細(xì)胞生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體攻膜復(fù)合物。既然補(bǔ)體和DC均能夠連接天然免疫和獲得性免疫，且在DC的表面又有C5b-9的沉積，因此我們推測，補(bǔ)體有可能通過調(diào)節(jié)DC分化發(fā)育成熟以及免疫學(xué)功能調(diào)節(jié)機(jī)

6、體的免疫應(yīng)答。為證實(shí)這一設(shè)想，我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了本研究。本研究的完成有助于在免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制方面獲得新的認(rèn)識，并對補(bǔ)體和DC之間在連接天然免疫和獲得性免疫之間的作用及相互關(guān)系能有更全面的了解，為進(jìn)一步從新的角度和思路深入研究DC在抗原特異性免疫應(yīng)答與免疫耐受中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 為明確亞溶破C5b-9(sublytic C5b-9，sC5b-9)對樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育影響，本研究共分三部分： 第一部分，外周血單核來源樹

7、突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)。選取38例健康志愿者外周血白膜，F(xiàn)icoll密度梯度離心獲得外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，貼壁法分離純化獲得較純的單核細(xì)胞(monocyte)，在GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(25ng/ml)聯(lián)合作用下誘導(dǎo)分化為未成熟樹突狀細(xì)胞(immaure dendritic cell,imDC)，于誘導(dǎo)的第5d，通過鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及流式檢測表面標(biāo)志

8、，結(jié)果顯示，貼壁后CD14<'+>單核細(xì)胞百分率達(dá)87％以上，rhGM-CSF+rhIL-4誘導(dǎo)后，細(xì)胞CD1a表達(dá)上調(diào)，CD14表達(dá)下降，說明誘導(dǎo)所獲細(xì)胞未典型imDC，建立了穩(wěn)定的體外DC培養(yǎng)體系。 第二部分，建立體外DC亞溶破模型。利用C5b6、C7、C8、C9補(bǔ)體蛋白純品，imDC膜表面組裝C5b-9，觀察細(xì)胞的狀態(tài)，激光共聚焦檢測C5b-9在imDC膜上的組裝情況，流式檢測組裝C5b-9后DC的凋亡情況，LDH釋放檢測

9、C5b-9對DC的溶破效應(yīng)。結(jié)果顯示，C5b-9在imDC膜上組裝成功，當(dāng)C5b6濃度小于0.8μg/ml時(shí)，C5b-9對DC膜的完整性沒有影響，但當(dāng)大于0.8μg/ml時(shí)，膜完整性隨著C5b6濃度的增加破壞加劇，因此確定了C5b-9對DC的體外亞溶破劑量為用小于0.8μg/ml C5b6，10μg/mlC7，10μg/ml C8，10μg/ml C9組裝的C5b-9，成功建立體外DC亞溶破模型。 第三部分，sC5b-9對imD

10、C成熟以及免疫學(xué)功能的影響。imDC膜上組裝sC5b-9，刺激3d后，流式檢測細(xì)胞表面的成熟分化標(biāo)志，HLA相關(guān)抗原以及共刺激分子的表達(dá)；流式分析抗原捕獲能力以及抗原捕獲相關(guān)分子；ELISA檢測sC5b-9處理DC細(xì)胞因子分泌情況：與同種異體CD4<'+>T、CD8<'+>T或CD4+CD45RA<'+>T細(xì)胞共培養(yǎng)，通過流式分析DC刺激的CD4<'+>T、CD8<'+>T等表面活化標(biāo)志、ELISA檢測CD4<'+>T、CD8<'+>T

11、或CD4<'+>CD45RA<'+>T細(xì)胞因子分泌情況，明確DC激活T細(xì)胞的能力。在各個實(shí)驗(yàn)時(shí)LPS(1μg/ml)、C5b-8，C5b-7，C5b6，C7，C8，C9同時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：與未刺激組相比，sC5b-9處理。DC表面分化標(biāo)志CD14及CD1a變化不顯著，成熟標(biāo)志CD83、HLA相關(guān)抗原、共刺激分子CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4、BTLA等表達(dá)上調(diào)；sC5b-9處理DC分泌IL-12及TNF-α上

12、調(diào)，抗原捕獲能力及抗原捕獲相關(guān)分子降低；sC5b-9處理DC刺激CD4<'+>T活化及分泌IFN-γIL-2能力增強(qiáng)，IL-10變化不顯著，但sC5b-9處理DC刺激CD8<'+>T活化及分泌IFN-γ、IL-2、IL-10均不顯著；sC5b-9處理DC與CD4<'+>CD45RA<'+>T共培養(yǎng)后檢測細(xì)胞因子分泌，發(fā)現(xiàn)CD4<'+> CD45RA<'+>T分泌IL-4降低而IFN-γ增加。以上結(jié)果表明，sC5b-9促進(jìn)的DC成熟，誘導(dǎo)

13、了Th1極化。 通過以上三部分的研究，我們得出如下結(jié)論： 直接貼壁法能獲得相對較純的單核細(xì)胞，利用rhGM-CSF聯(lián)合rhIL-4貼壁的單核細(xì)胞，隔日半量補(bǔ)充細(xì)胞因子，在第5d能獲得典型的imDC。 利用補(bǔ)體蛋白純品C5b6、C7、C8、C9在合適條件下能體外于imDC膜表面組裝C5b-9，當(dāng)補(bǔ)體純品C5b6濃度小于0.8ug/mL時(shí)，組裝的C5b-9為亞溶破型。 sC5b-9能促進(jìn)imDC向成熟DC轉(zhuǎn)變

14、，同時(shí)抗原捕獲能力降低，IL-12和TNF-α分泌上調(diào)；sC5b-9處理DC同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力增加，激活CD4<'+>T細(xì)胞能力提高并誘導(dǎo)初始T細(xì)胞Th1極化。 綜上所述，作為天然免疫重要組成部分的補(bǔ)體系統(tǒng)，除了能夠直接殺傷入侵的病原微生物外，還可以通過在活化形成的攻膜復(fù)合物C5b-9調(diào)控機(jī)體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞-DC的成熟以及免疫學(xué)功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。上述研究結(jié)果對于深入認(rèn)識天然免疫和獲得性免疫之間的作用以