1、高密度發(fā)酵是近年來發(fā)酵工業(yè)的重要研究方向之一。通過選育優(yōu)良菌種，研究酒精酵母的高密度培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)，提高酵母的酒精耐受性，降低產(chǎn)物或高滲透壓底物對酵母發(fā)酵的毒害和抑制作用，提高酒精生產(chǎn)效益，對加快燃料酒精的產(chǎn)業(yè)化進程，推進綠色能源替代和國家能源安全，減少環(huán)境污染具有重要意義。 本文通過選擇優(yōu)良菌種，采用恒速和分批補料流加培養(yǎng)方式，優(yōu)化工藝條件實現(xiàn)了發(fā)酵液中較高的細(xì)胞密度和單位體積酒精產(chǎn)量；同時對高密度酵母酒精耐受性能、發(fā)酵性能和

2、循環(huán)使用性能進行實驗研究。本論文的主要工作和研究成果如下： (1)對釀酒酵母菌Saccharomy cescerevisiae As2.458進行搖瓶分批培養(yǎng)，在最適生長條件(搖床轉(zhuǎn)速150rpm，溫度28℃，初始糖濃度40g·L-1，甘氨酸濃度3g·L-1)下，菌體密度達(dá)到9.01g·L-1。發(fā)酵糖濃度為250g·L-1的木薯糖化液，生產(chǎn)酒精濃度達(dá)到11.7％，比普通酵母濃度發(fā)酵生產(chǎn)酒精濃度提高24.5％。實驗結(jié)果表明提高發(fā)酵

3、液酵母濃度，可顯著提高發(fā)酵酒精濃度和單位體積酒精產(chǎn)量。但釀酒酵母酒精耐受性以及酒精致死量偏低，在酒精濃度為10％時不能正常生長和發(fā)酵代謝，菌株作為工業(yè)酒精發(fā)酵菌種需要進一步改良。 (2)通過分批、分批補料流加和連續(xù)恒速流加培養(yǎng)策略培養(yǎng)絮凝酒精酵母菌Saccharomy cescerevisiae4-S。結(jié)果顯示，分批補料流加或連續(xù)流加(流加速率0.133g·L-1·m-1)有利于酒精酵母菌S.cerevisia4-S的快速生長和

4、得到較高的細(xì)胞濃度，分批補料流加或連續(xù)流加培養(yǎng)44h，發(fā)酵液中酒精酵母細(xì)胞濃度(DCW)分別達(dá)到71.82g·L-1和82.01g·L-1，比分批培養(yǎng)分別提高了155.68％和191.95％，獲得了較高的酒精酵母細(xì)胞濃度。 (3)對高密度酵母酒精耐受性能考察，結(jié)果顯示高密度酵母可耐受12％(v/v)胞外酒精；菌體于30℃，18％(v/v)酒精沖擊2h的細(xì)胞存活率為42％。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3g·L-1甘氨酸、0.5g·L-1(NH

5、4)2SO4和2.6g·L-1KH2PO4能有效提高菌體的酒精耐受性能，18％(V/V)酒精沖擊2h的細(xì)胞存活率提高到57％。 (4)利用Plackett-Burman實驗設(shè)計確定了影響高密度酵母發(fā)酵性能的關(guān)鍵因素分別為糖濃度和胞外酒精濃度，響應(yīng)面分析法優(yōu)化兩影響因素得出極值點分別為350g·L-1和11.6％(v/v)，通過驗證性實驗證實了模型的有效性。對優(yōu)化后高密度酵母發(fā)酵性能的研究，結(jié)果顯示酵母發(fā)酵糖濃度為350g·L-1

6、發(fā)酵液生產(chǎn)酒精濃度達(dá)到16.23％，發(fā)酵時間比普通酵母濃度批發(fā)酵時間縮短12h，酒精濃度提高24.4％。 (5)對高密度酒精酵母進行循環(huán)酒精發(fā)酵實驗，結(jié)果顯示，前四批次生產(chǎn)的酒精濃度保持在13％以上，顯示出良好的可重復(fù)循環(huán)發(fā)酵能力；第五批次后酵母重復(fù)利用發(fā)酵生產(chǎn)酒精的能力呈明顯下降趨勢。經(jīng)過活化的酒精酵母進行循環(huán)酒精發(fā)酵，前七批次發(fā)酵液中酒精濃度保持在13％以上，第八批次后生產(chǎn)酒精濃度明顯下降，說明中間活化對酒精酵母的重復(fù)循環(huán)發(fā)