1、鯽（Carassius auratus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。鯽造血器官壞死癥是目前危害養(yǎng)殖鯽最為嚴(yán)重的病毒性疾病，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）。鯽造血器官壞死癥流行范圍廣、傳染性強(qiáng)，死亡率高，給鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，鯽造血器官壞死癥尚缺乏有效的防控和治療方法。疫苗免疫被認(rèn)為是預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物傳染性疾病特別是病毒性疾病最為有效的方法

2、。鯉皰疹病毒Ⅱ型細(xì)胞疫苗制備主要以細(xì)胞瓶貼壁方式培養(yǎng)病毒，是疫苗規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸因素，探索鯽腦組織細(xì)胞（GiCB）與鯉皰疹病毒Ⅱ型規(guī)?；囵B(yǎng)工藝具有潛在的應(yīng)用前景。本論文針對鯉皰疹病毒Ⅱ型細(xì)胞疫苗規(guī)?；苽渑c應(yīng)用過程中存在的關(guān)鍵工藝問題，開展了鯽腦組織細(xì)胞與鯉皰疹病毒Ⅱ型微載體培養(yǎng)技術(shù)及其滅活疫苗浸泡免疫效果的研究，旨在為鯽造血器官壞死癥的有效防控提供新的技術(shù)途徑。本論文主要研究內(nèi)容如下：
　　1、研究了在Cephodex微載體懸

3、浮培養(yǎng)系統(tǒng)中規(guī)?；囵B(yǎng)鯽腦組織細(xì)胞和鯉皰疹病毒Ⅱ型的工藝。結(jié)果表明，Cephodex微載體適合GiCB細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁期培養(yǎng)基中血清濃度為10％，微載體濃度為6g/L；細(xì)胞初始接種密度為2.5×105 cells/mL時(shí)，以轉(zhuǎn)速35rpm，每靜置30min攪拌2min的間歇攪拌方式貼壁率最佳，8h后貼壁率可達(dá)90%以上；增殖期以45rpm的連續(xù)攪拌速度可獲得最佳的細(xì)胞生長效能。采用優(yōu)化的工藝條件，以感染復(fù)數(shù)為0.2的CyHV-2

4、病毒接種規(guī)?；囵B(yǎng)的GiCB細(xì)胞5d后，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒滴度（TCID50/mL）可達(dá)106.50±0.30。本項(xiàng)研究為鯽造血器官壞死癥疫苗的規(guī)?；苽浼夹g(shù)奠定了前期基礎(chǔ)。
　　2、用β-丙內(nèi)酯（β-propiolactone，BPL）滅活微載體細(xì)胞培養(yǎng)的鯉皰疹病毒Ⅱ型制備滅活疫苗，分別用105TCID50/mL和104TCID50/mL的疫苗劑量作為免疫原浸泡免疫健康異育銀鯽魚苗（3.20±0.15cm），部分免疫魚

5、苗在免疫后第4周和第8周后分別進(jìn)行浸泡感染攻毒實(shí)驗(yàn)，確定不同免疫劑量疫苗的保護(hù)效果。同時(shí)，另一部分免疫魚苗在首次浸泡4周后同法加強(qiáng)免疫一次，并于二次免疫后第2、4、7、14、21和28天采集魚體樣本，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IgM、IL-11和C3補(bǔ)體基因的相對表達(dá)量。攻毒感染實(shí)驗(yàn)后取各組的感染死魚進(jìn)行PCR病毒檢測確定病原并利用TaqMan real-time PCR確定每尾魚體的病毒載量。研究結(jié)果顯示，免疫4周后免疫劑量105TC

6、ID50/mL和104TCID50/mL的相對免疫保護(hù)率分別為52%和48%，免疫8周后兩種免疫劑量的相對免疫保護(hù)率分別為61.6%和53.9%，加強(qiáng)免疫組相對免疫保護(hù)率分別為73.1%和65.4%。加強(qiáng)免疫后IgM、IL-11和C3補(bǔ)體基因的相對表達(dá)量與對照組相比均上調(diào)。攻毒感染實(shí)驗(yàn)后，病死魚PCR病毒檢測均顯示陽性。加強(qiáng)免疫組感染死魚的病毒載量顯著高于其他組（P＜0.01）。由此可見，鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗浸