1、研究背景:茜草科(Rubiaceae)鉤藤植物是常用中藥，被《中華人民共和國藥典》2010年版收載，其中正品鉤藤包括:鉤藤Uncaria rhynchophylla(Miq) Miq.ex Havil.、大葉鉤藤Uncaria macrophylla Wall.、毛鉤藤Uncaria hirsute Havil.、華鉤藤Uncaria sinensis(Oliv.) Havil.、無柄果鉤藤Uncaria sessilifructus

2、Roxb.。其藥用歷史可追溯到魏晉時期，《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》、《藥性論》等古籍均有記載。鉤藤味甘，性涼，歸肝、心包經(jīng)，具有息風定驚、清熱平肝的功效。主治肝風內(nèi)動，驚癇抽搐，高熱驚厥，感冒夾驚，小兒驚啼，妊娠子癇，頭痛眩暈，多以復方入藥?，F(xiàn)代主要用于治療原發(fā)性及繼發(fā)性高血壓、腦神經(jīng)性疾病及腦血管疾病，還可用于治療癲癇、老年期癡呆和防治藥物依賴。
　　 鉤藤堿(Rhynchophylline，Rhy)是鉤藤中含量最高的吲哚類生

3、物堿，占總生物堿的20～30％，其他生物堿還包括異鉤藤堿、柯諾辛堿、柯諾辛堿B、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿及柯楠因堿等。現(xiàn)代藥理研究表明鉤藤堿主要作用于心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不僅在高血壓、心律失常、心肌肥大、血栓等方面具有療效;而且在腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、癲癇、驚厥、焦慮癥、藥物依賴方面也具有神經(jīng)保護作用。其作用機制與抑制L-鈣通道和鉀通道，拮抗NMDA受體和AMPA受體，調(diào)節(jié)谷氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、乙酰膽堿、內(nèi)啡肽、5-

4、羥色胺等中樞神經(jīng)遞質(zhì)的代謝有關。
　　 NMDA受體是與Ca2+通道偶聯(lián)的離子型興奮性氨基酸受體。天然的NMDA受體由NR1、NR2和NR3三種亞基組成的異聚體。其中NR2又分為NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4個亞型。NR1是基本的功能單位，NR2決定受體的性質(zhì)，NR3在NMDA受體中主要發(fā)揮抑制作用。NMDA受體廣泛分布于腦、脊髓和外周組織。NMDA受體拮抗劑分為競爭性和非競爭性拮抗劑兩類。競爭性NMDA受體拮抗劑作用

5、于興奮性氨基酸的識別位點，如AP5、AP7、CPP等。非競爭性NMDA受體拮抗劑作用于離子通道，如MK-801、氯胺酮、PCP等。非選擇性的NMDA受體拮抗劑存在嚴重的不良反應，包括擬精神病藥作用和對運動功能的影響。NR2B選擇性拮抗劑，如:艾芬地爾、依利羅地、氟哌啶醇、苯丙氨酯具有神經(jīng)保護、抗驚厥、鎮(zhèn)痛等作用。NMDA受體的激活可以觸發(fā)長時程增強和長時程抑制，是大腦學習、記憶、認知、突觸可塑性的生理機制。但是，NMDA受體的過度激活也

6、可引發(fā)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦中風、帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇、亨廷頓舞蹈病、精神分裂癥等。
　　 有文獻報道，鉤藤的水提物具有抗焦慮作用。本課題組前期進行的鉤藤堿藥效學實驗表明，鉤藤堿(60 mg/kg)增加小鼠在5分鐘內(nèi)進入開臂次數(shù)和延長在開臂滯留的時間，增加10分鐘內(nèi)的穿箱次數(shù)和延長在明箱滯留的時間，證實鉤藤堿確有抗焦慮的功效。但是，鉤藤堿抗焦慮作用的機制仍未明確。前期研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿抑制苯丙胺誘導的條件性位置偏愛大鼠杏

7、仁核和伏核中NR2BmRNA和蛋白的表達，且鉤藤堿本身無精神依賴作用。還發(fā)現(xiàn)鉤藤堿抑制NMDA受體鈣通道的激活，降低甲基苯丙胺引起的原代皮質(zhì)神經(jīng)元胞內(nèi)的鈣超載，具有神經(jīng)保護作用，提示鉤藤堿可能是NMDA受體抑制劑。我們推測，鉤藤堿抗焦慮作用可能與NMDA受體有關。
　　 研究目的:鉤藤堿不僅在高血壓、心律失常、心肌肥大、血栓等心血管方面具有療效;而且在腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、癲癇、驚厥、焦慮癥、藥物依賴等神經(jīng)系統(tǒng)方面具有

8、保護作用。的鉤藤堿藥效學預實驗證實，鉤藤堿具有抗焦慮的作用，但機制尚未明確。藥物依賴的藥理學實驗表明，鉤藤堿可能是NMDA受體抑制劑。鉤藤堿是否通過調(diào)節(jié)NMDA受體發(fā)揮抗焦慮效應是本文關注的重點。鑒于以上分析，在本課題組前期研究的基礎上，本文以原代培養(yǎng)的新生鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，從定位、定量、定性三個角度觀察鉤藤堿對NMDA受體NR1、NR2B亞基的影響。
　　 實驗方法:
　　 1.原代海馬神經(jīng)元模型的建立和鑒定:取

9、24 h內(nèi)的SD新生鼠，急性處死，鈍性分離左右海馬，剝?nèi)ツX膜，剪成粥糜狀，用0.125％胰酶于37℃消化30 min，終止消化后，輕輕吹打至組織塊消失。所有操作在冰上進行。將細胞懸液過200目篩網(wǎng)，離心。種植培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×105個/ml，按2ml/孔接種于6孔板中。37℃，5％ CO2孵箱中孵育。12h內(nèi)換維持培養(yǎng)基，以后每4天半量換液。倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長情況。神經(jīng)元特異性烯醇化酶鑒定。在顯微鏡下觀察，隨機選取五個視野，

10、計數(shù)每個視野中陽性細胞數(shù)，計算海馬神經(jīng)元平均純度。
　　 2.NR1和NR2B亞基在神經(jīng)元上的共定位表達:將原代的海馬神經(jīng)元以5×105個/ml的密度接種于預包被的小玻片上，待生長至第8天時，取形態(tài)良好的細胞用于后續(xù)的實驗。用免疫熒光雙標法對細胞進行染色，一抗為兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B，二抗為FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠，DAPI染核。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
　　 3.MTT法分別檢測鉤藤堿和MK

11、-801的神經(jīng)毒性:根據(jù)鉤藤堿和MK-801的測試濃度，將生長至6天的原代神經(jīng)元分為8組，即空白對照組、正常對照組、50μmol/L組、100μmol/L組、200μmol/L組、400μmol/L組、800μmol/L組、1000μmol/L組。以1×106個/ml的密度接種于預包被的96孔板內(nèi)，每組6個復孔，每孔接種100μl，空白對照組不接種細胞，以100μl培養(yǎng)基替代。將1 mmol/L鉤藤堿和MK-801母液稀釋成50μmol

12、/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L，每孔加入相應濃度的含藥維持培養(yǎng)基100μl，空白對照組和正常對照組每孔加入100μl新鮮的維持培養(yǎng)基。37℃、5％C02孵育48 h。按照MTT實驗步驟，分別檢測鉤藤堿和MK-801處理后神經(jīng)元的活力，用酶標儀在490 nm波長下測定光密度值，重復3次實驗。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分

13、析，組間比較采用單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 4.鉤藤堿對NR1和NR2B mRNA表達的影響:將新生鼠原代海馬神經(jīng)元以1×106個/ml接種于預包被的6孔板內(nèi)，6天后，將細胞分為正常對照組、MK-801200μmol/L組、鉤藤堿100μmol/L組、鉤藤堿200μmol/L組、鉤藤堿400μmol/L組。將1mmol/L M

14、K-801母液稀釋成200μmol/L，1mmol/L鉤藤堿母液分別稀釋為100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L。正常對照組給予新鮮維持培養(yǎng)基2ml/孔，其余各組給予相應濃度的含藥培養(yǎng)基2ml/孔，37℃、5％CO2分別孵育6h和48 h。采用Real-time PCR技術檢測各組NR1和NR2B mRNA的表達。每組3個復孔，重復3次實驗。所有數(shù)據(jù)以(x)±s表示，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單

15、因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 5.鉤藤堿對NR1和NR2B蛋白表達的影響:將新生鼠原代海馬神經(jīng)元以5×105個/ml接種于放有預包被小玻片的6孔板內(nèi)，6天后，將細胞分為正常對照組、MK-801200μmol/L組、鉤藤堿400μmol/L組，每組3個復孔。將1mmol/LMK-801母液稀釋成200μmol/L，1mmol/L鉤藤

16、堿母液稀釋為400μmol/L。正常對照組給予新鮮維持培養(yǎng)基2ml/孔，其余各組給予相應濃度的含藥培養(yǎng)基2ml/孔，37℃、5％CO2分別孵育48 h。按照免疫熒光雙標法的操作步驟，進行細胞染色。一抗為兔抗大鼠NR1和小鼠抗大鼠NR2B，二抗為FITC-羊抗兔和CY5-羊抗小鼠，DAPI染核。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，拍照時保持每張片子的儀器參數(shù)一致。IPP5.1軟件對細胞進行熒光強度分析，分別計算單個神經(jīng)元FITC、CY5和DAP

17、I的平均熒光強度。
　　 實驗結果:
　　 1.神經(jīng)元形態(tài)觀察、鑒定和純度計算:神經(jīng)元接種6～8 d后，胞體較大，呈三角形、圓形或橢圓形，透光性強，周邊有光暈。神經(jīng)元突起增長增粗，交織成網(wǎng)狀，細胞完全成熟，可用于實驗。14d后，雜細胞增多，細胞慢慢老化。神經(jīng)元特異性烯醇化酶鑒定細胞為陽性。經(jīng)計算，神經(jīng)元純度最低值為85.9％，最高值為97.5％，平均純度為（92.6±4.62）％。胰酶消化法結合無血清培養(yǎng)能成功建立原代海

18、馬神經(jīng)元模型，6～8 d的神經(jīng)元形態(tài)和純度均達到實驗要求。
　　 2.NR1和NR2B在神經(jīng)元上的共定位:NR1主要分布于神經(jīng)元的軸突和樹突干及近突起的胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上;NR2B分布于胞體膜、軸突和樹突膜上，在神經(jīng)元的郎飛結和突觸末端有高密度分布。NR1和NR2B在突觸末端、樹突干、樹突棘共定位表達，表明NR1和NR2B可能與離子流動、神經(jīng)沖動的傳導、遞質(zhì)的調(diào)節(jié)有關。
　　 3.鉤藤堿和MK-801的神經(jīng)毒性:鉤藤堿和MK

19、-801的OD-C曲線均呈現(xiàn)“反S”形。鉤藤堿400μmol/L以下處于平臺期，對神經(jīng)元的活力無影響;400～1000μmol/L處于斜線期，隨著濃度的增大，鉤藤堿的神經(jīng)毒性也逐漸增大;大于1000μmol/L處于平臺期，鉤藤堿對神經(jīng)毒性不隨濃度增大而增大。MK-801在200μmol/L以下處于平臺期，對神經(jīng)元活力無影響;200～800μmol/L處于斜線期，MK-801的神經(jīng)毒性隨濃度增大而增大;大于800μmol/L處于平臺期，M

20、K-801的神經(jīng)毒性不隨濃度的增大而增大。鉤藤堿各濃度OD值比MK-801高，表明鉤藤堿毒性要比MK-801小。篩選出鉤藤堿的安全實驗濃度為100μmo l/L、200μmol/L、400μmol/L，MK-801的濃度為200μmol/L。
　　 4.鉤藤堿對NR1和NR2B mRNA的表達:MK-801作用6h后，MK-801下調(diào)NR1和NR2B mRNA的表達;作用48 h后，MK-801上調(diào)NR1和NR2BmRNA的表達

21、。鉤藤堿作用6h，鉤藤堿低、中、高劑量組NR1 mRNA增高，對NR2B mRNA表達沒有影響;作用48 h后，鉤藤堿低、中、高劑量組上調(diào)NR1 mRNA的表達，下調(diào)NR2B mRNA表達。MK-801對NR1和NR2B mRNA的表達隨時間變化呈先降后升的趨勢。鉤藤堿對NR1 mRNA的表達均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，對NR2B mRNA的表達呈下降趨勢。鉤藤堿可能選擇性抑制NR2B的表達。
　　 5.鉤藤堿對NR1和NR2B蛋白表達

22、的影響:藥物處理48 h后，與正常組相比，鉤藤堿增強神經(jīng)核周圍的NR1蛋白表達，對胞膜上NR1影響不明顯，降低樹突上NR2B的膜表達;MK-801明顯增強神經(jīng)核周圍NR1的蛋白表達，并呈點狀分布，樹突棘上NR2B表達增高。
　　 結論:
　　 1.胰酶消化法結合無血清培養(yǎng)能獲得純度較高、穩(wěn)定可靠的神經(jīng)元模型。
　　 2.NR1分布于神經(jīng)元軸突、樹突干和突起端的胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上，NR2B分布于神經(jīng)細胞膜、軸突膜、樹突

23、膜上，在神經(jīng)元的突觸末端、樹突棘和郎飛結有高密度分布。
　　 3.鉤藤堿在低濃度下具有神經(jīng)保護，最大安全濃度為400μmol/L，隨著濃度的增加，細胞毒性增加，大于1000μmol/L，細胞活力降到最低值;MK-801在低濃度下對神經(jīng)元無影響，最大安全濃度為200μmol/L，隨著濃度的增加，細胞毒性增加，1000μmol/L細胞活力降到最低值。
　　 4.鉤藤堿上調(diào)NR1 mRNA的表達，具有濃度依賴性和時間依賴性;下