1、研究目的：制備結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)抗原；對(duì)本實(shí)驗(yàn)組制備的CTGF單克隆抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)；運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)篩選結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的抗原表位。 研究方法：1、從人血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取總：RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增CTGF-C區(qū)242-349位氨基酸基因，插入噬菌體包膜蛋白基因的上游，制備出CTGF融合蛋白；2、采用體外人腎系膜細(xì)胞珠培養(yǎng)方法，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM干預(yù)2天

2、后提取結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)蛋白，用Western blot方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)組制備的CTGF單克隆抗體特異性及CTGF融合蛋白進(jìn)行定性檢測(cè)；3、以CTGF單克隆抗體為篩選工具，對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行篩選，逐步增加選擇壓力，經(jīng)過(guò)三輪篩選后隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，用競(jìng)爭(zhēng)抑制和間接ELISA方法檢測(cè)噬菌體陽(yáng)性克隆的特異性。 結(jié)果：1、成功克隆CTGF-C區(qū)基因，插入表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得分子量為30ku的融合蛋白，免疫學(xué)

3、檢測(cè)證實(shí)為CTGF蛋白；2、Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：本實(shí)驗(yàn)組制備的CTGF單克隆抗體既可以與天然CTGF蛋白結(jié)合，也可以與重組CTGF蛋白結(jié)合；3、噬菌體文庫(kù)經(jīng)過(guò)三輪篩選后得到了陽(yáng)性克隆。測(cè)序結(jié)果表明，隨機(jī)挑取的4個(gè)陽(yáng)性克隆的序列高度一致。推導(dǎo)獲得12個(gè)氨基酸的小肽序列(GEPQTKLFSFPL)，命名為ZD521；競(jìng)爭(zhēng)抑制和間接ELISA分析結(jié)果表明：CTGF單克隆抗體與陽(yáng)性噬菌體的結(jié)合具有特異性。 結(jié)論：本研究利