1、目的:心肌梗死是冠狀動(dòng)脈持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，嚴(yán)重危害人類的健康。心肌梗死后發(fā)生心室重構(gòu)、導(dǎo)致心肌肥大，心肌纖維化，最終形成心力衰竭。多年來(lái)雖有許多治療方法，包括介入、藥物治療、外科手術(shù)等等，還包括嘗試干細(xì)胞移植在內(nèi)的先進(jìn)技術(shù)，但無(wú)法中斷心衰的進(jìn)展，因此尋求更有效更先進(jìn)的治療方法已成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。近幾年，基因治療越來(lái)越被人們廣泛接受，大量文獻(xiàn)顯示microRNAs(miRNAs)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝過(guò)程。最近

2、miRNAs與心血管疾病的研究逐漸增多，其中microRNA-214(miR-214)是新發(fā)現(xiàn)的因子。近期有研究報(bào)道m(xù)iR-214對(duì)心肌有保護(hù)作用，但對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。當(dāng)心肌收縮力減弱時(shí)，心臟排血量降低，腎血流量隨之減低，從而腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rein-angiotensin-aldosterone system，RAAS)被激活。RAAS被激活后，血管緊張素（Angiotensin，AngⅡ）分泌增加，刺

3、激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，使膠原纖維合成增多，促使心肌間質(zhì)纖維化，發(fā)生心室重構(gòu)。因此本研究采用AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts，CFS)，建立心肌成纖維細(xì)胞纖維化模型，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214來(lái)觀察miR-214對(duì)AngⅡ刺激CFS纖維化的作用，意圖尋找出延緩心室重構(gòu)，抑制心肌纖維化的有效方法。
　　方法:
　　1.心肌成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定取出生1-3天的SD乳大鼠，低溫麻醉，取出心

4、室肌組織剪成小塊，用胰酶消化法通過(guò)差時(shí)貼壁分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，用波形蛋白(Vimentin)來(lái)鑒定其純度。
　　2.不同濃度不同時(shí)間AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞的作用取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngⅡ刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control)，AngⅡ作用組(AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí))，通過(guò)MTT比色法檢測(cè)各組

5、細(xì)胞增殖能力;再取適當(dāng)濃度，作用不同時(shí)間(6h、12h、24h)，同樣用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。
　　3.不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)后CFS分泌膠原的變化取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngⅡ刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分組（同方法2）:正常對(duì)照組(normal control)，AngⅡ作用組（AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)羥脯氨酸測(cè)試

6、盒檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的膠原含量;再取AngⅡ10-6mol/L濃度，作用不同時(shí)間(6h、12h、24h)，同樣用羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的膠原含量。
　　4.Q-PCR法檢測(cè)不同濃度AngⅡ作用下的心肌成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá)取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngⅡ刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組(normal control)，AngⅡ作用組（AngⅡgroup，濃度分別為10-8、10-7、

7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(real time PCR)測(cè)定不同濃度AngⅡ作用后成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平。
　　5.Q-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-214后，心肌成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá)取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為五組（正常對(duì)照組、前體組、前體空白對(duì)照組、抑制劑組、抑制劑空白對(duì)照組，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(real t

8、ime PCR)測(cè)定各組中miR-214的表達(dá)水平。
　　6.Q-PCR法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214后，再經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá)取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)行饑餓處理再給予10-6mol/L AngⅡ刺激，然后提取總RNA。實(shí)驗(yàn)分為六組（正常對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+前體組、AngⅡ+前體空白對(duì)照組

9、、AngⅡ+抑制劑組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(realtime PCR)測(cè)定各組中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá)水平。
　　7.Western法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214后，再經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達(dá)取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)行饑餓處理再給予1

10、0-6mol/L AngⅡ刺激，然后提取總蛋白。實(shí)驗(yàn)分為六組（正常對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+前體組、AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組），通過(guò)Western法檢測(cè)定各組中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2、TGFβ1、的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定心肌成纖維細(xì)胞總體呈‘S’型趨勢(shì)生長(zhǎng)，2～4天處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天之后進(jìn)入平臺(tái)期。光鏡下呈三角形，梭

11、行或多邊形;免疫組化結(jié)果顯示vimentin陽(yáng)性部位可見(jiàn)棕黃色細(xì)絲狀或點(diǎn)狀細(xì)密顆粒(Vimentin)存在于細(xì)胞胞漿中，分布較均勻，純度達(dá)95％。
　　2.AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞活力的影響MTT檢測(cè)結(jié)果提示，心肌成纖維細(xì)胞增殖能力隨著AngⅡ濃度的升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。我們選取引起細(xì)胞增殖約50％左右的AngⅡ濃度（10-6mol/L）作用24h，建立心肌成纖維細(xì)胞纖維化模型。
　　3.

12、AngⅡ?qū)FS分泌膠原的影響羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)結(jié)果提示，經(jīng)AngⅡ干預(yù)后，與正常對(duì)照組相比，AngⅡ(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)組的羥脯氨酸含量隨AngⅡ濃度的升高作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明心肌成纖維細(xì)胞分泌的膠原蛋白隨AngⅡ濃度的升高作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。
　　4.不同濃度AngⅡ作用對(duì)心肌成纖維細(xì)胞中miR-214表達(dá)的影響q-PCR檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組相比，AngⅡ組miR-214的表達(dá)水平

13、顯著下降，且隨AngⅡ濃度的升高逐漸下降。
　　5.經(jīng)miR-214轉(zhuǎn)染后心肌成纖維細(xì)胞miR-214的表達(dá)q-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)入前體組的miR-214表達(dá)水平明顯高于前體空白對(duì)照組，而轉(zhuǎn)入抑制劑組的miR-214表達(dá)水平明顯低于抑制劑空白對(duì)照組，正常對(duì)照組與前體空白對(duì)照組、抑制劑空白對(duì)照組相比無(wú)差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。
　　6.miR-214對(duì)AngⅡ干預(yù)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、MMP-1、MMP

14、-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá)的影響q-PCR檢測(cè)顯示:AngⅡ組中CFS的COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01);AngⅡ+前體組CFS中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平明顯低于AngⅡ組（P＜0.01），而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制劑組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1 mRNA表達(dá)水平顯著高

15、于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平與AngⅡ組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AngⅡ組中CFS的MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05);AngⅡ+前體組中MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平明顯高于AngⅡ組(P＜0.01)，而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制

16、劑組MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平顯著低于AngⅡ組(P＜0.01)。AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平與AngⅡ組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　7.miR-214對(duì)AngⅡ干預(yù)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLⅠ、COLⅢ、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達(dá)的影響Western-blot法檢測(cè)顯示:AngⅡ組中CFS的COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達(dá)

17、水平明顯高于正常細(xì)胞組(P＜0.05);AngⅡ+前體組CFS中COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達(dá)水平明顯低于AngⅡ組(P＜0.05)，而COLⅠ、COLⅢ蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，TGFβ1蛋白表達(dá)水平稍高于AngⅡ組(P＜0.05)。在AngⅡ+抑制劑組COLⅠ、COLⅢ、TGFβ1蛋白表達(dá)水平顯著高于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組COLⅠ、CO

18、LⅢ、TGFβ1蛋白表達(dá)水平與AngⅡ組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。AngⅡ組中CFS的MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）;AngⅡ+前體組中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯高于AngⅡ組(P＜0.05)，而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在AngⅡ+抑制劑組MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著低于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照

19、組MMP-1蛋白表達(dá)水平稍低于AngⅡ組(P＜0.05)。AngⅡ+前體空白對(duì)照組、AngⅡ+抑制劑空白對(duì)照組MMP-2蛋白表達(dá)水平與AngⅡ組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，并且呈濃度和時(shí)間依賴性。AngⅡ(10-6mol/L)作用心肌成纖維細(xì)胞24h可使活力提升50％左右。
　　2.在心肌成纖維細(xì)胞中，miR-214的表達(dá)隨AngⅡ濃度的升高而成下降趨