1、1.研究目的：1.1建立小鼠FLV感染模型，以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物AZT作為對照藥，通過對該小鼠模型的脾指數(shù)，脾臟病理切片等指標分析，初步探討毛冬青對逆轉(zhuǎn)錄病感染的治療作用，并評價其對FLV所致脾大癥的保護作用。 1.2建立小鼠FLV感染模型，以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物AZT作為對照，通過對該小鼠模型的CD4T、CD8T、CD4T/CD8T等指標分析，初步探討毛冬青對逆轉(zhuǎn)錄病感染后機體的CD4T，CD8T，以及CD4T/CD8T的影響作用，

2、并評價其效果，并初步分析其作用的機制。 1.3建立小鼠FLV感染模型，以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物AZT作為對照，通過對小鼠血清IL-1β，IL-2，IL-6及INF-γ的測量，探討毛冬青對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的作用機制，及其對免疫系統(tǒng)的調(diào)控機制，評價其效果，為進一步認識和發(fā)掘該藥，并將來應(yīng)用治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染提供實驗依據(jù)和可靠數(shù)據(jù)。 1.4以合適濃度FLV脂質(zhì)體感染PA317(鼠胚腎成纖維細胞-逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞)，傳代5次后獲得穩(wěn)定

3、的表達FLV的PA317-FLV株。并以RT-PCR法鑒定該細胞株的表達。以NIH3T3細胞作為效應(yīng)細胞檢驗MDQ作用后PA317-FLV細胞所產(chǎn)生的病毒的效價。以MDQ作用于PA317-FLV細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MDQ作用前后PA317-FLV鈣離子通道的變化情況，探討MDQ作用于PA317-FLV的分子水平的作用機制。 2.研究方法：2.1實驗動物造模及指標檢測：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1日后，腹腔注射0.4ml×10-1F

4、LV病毒原液攻毒后，隨機分為空白對照組(簡稱KB組)、MDQ高劑量組(簡稱MG組)、MDQ中劑量組(簡稱MZ組)、MDQ低劑量組(簡稱MD組)、AZT組每組10只。常規(guī)喂養(yǎng)。攻毒當日開始灌胃口服給藥。正常對照組口服灌胃生理鹽水0.4ml/只/日。MDQ組分別給予相當于60kg體重的成人每日每公斤用藥量的5倍(含生藥2.166g/kg)、10倍(含生藥4.33g/kg)和20倍(含生藥8.67g/kg)劑量灌胃；模型組灌以等量生理鹽水；A

5、ZT組按100mg/kg體重灌胃，每天按時喂藥，連續(xù)21天。每組小鼠按0.4ml/只/日進行給藥。所有體內(nèi)實驗小鼠于21天時摘眼球取血處死。 2.2脾指數(shù)的測定：小鼠摘眼球處死前稱體重，以眼科剪，沿腹部正中線剪開腹腔，在橫隔左側(cè)可見脾臟，鈍性分離脾臟，清除脂肪結(jié)締組織，鼠脾稱濕重，按以下公式計算脾指數(shù)脾指數(shù)=脾重/體重×100％。稱重完成后將脾臟剪成5mm厚度的小塊放入10％甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，HE染色、切片觀察。

6、 2.2CD3T、CD4T、CD8T、CD4T/CD8T檢測：小鼠摘眼球處死后，鼠血立即EDTA抗凝處理，取鼠血50μl加入熒光標記CD3T、CD4T、CD8T單克隆抗體購買自晶美生物制品公司。各2.5μl，30分鐘室溫避光孵育后加入溶血素，10分鐘后以1mlPBS以1000G離心5-10分鐘，倒上清后，上流式細胞儀檢測。 2.3ELISA法檢測FLV小鼠血清IL-1β，IL-2，IL-6及INF-γ含量：小鼠給藥21天后

7、，稱鼠體重后，摘眼球取血處死小鼠。鼠血不抗凝，室溫靜置4小時后，4000G離心取血清約400l。按試劑盒說明。同時檢測四個指標。 2.4FLV轉(zhuǎn)染PA317細胞取對數(shù)生長期的PA317細胞，轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪二十四孔板，每板培養(yǎng)基相同0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中，鏡下觀察，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90％。轉(zhuǎn)染時對于每孔細胞，使用50μl無血清培養(yǎng)基(OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋FLV毒種混懸液

8、至10-1，10-2，10-3，10-4，每種濃度6個孔。每孔細胞，使用50μlOPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μlLIPOFECTAMINE2000試劑，室溫靜置30分鐘后移入細胞培養(yǎng)箱中。 在轉(zhuǎn)染后8小時，10-1濃度組細胞貼壁差，細胞成片脫落，僅有1孔細胞仍保持貼壁。24小時后，10-2組細胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。72小時后，僅10-3、10-4兩組細胞仍然貼壁，但鏡下觀察，10-3組細胞，出現(xiàn)空斑，而10-4細胞形態(tài)仍表現(xiàn)

9、良好，故而選取10-4濃度作為轉(zhuǎn)染濃度，經(jīng)2-3次傳代后，將細胞凍存并進入后面的實驗。 2.5空斑形成實驗：將對數(shù)生長期NIH3T3細胞用胰酶消化后移入平雙放皿中，加高糖培養(yǎng)液，1％胎牛血清，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。48小時細胞致密成片后，用吸管吸出培養(yǎng)液。加入10毫升無血清維持液，放37℃1小時。吸出維持液，取PA317-FLV上清200μL與NIH3T3細胞放37℃，5％CO2孵箱中1小時使病毒吸附于細胞。加入在44℃

10、預(yù)溫的營養(yǎng)性瓊脂20毫升，放入37℃，5％CO2孵箱中24小時，加入第二層含有中性紅的瓊脂時，將細胞面向上放于無燈光照射的37℃培養(yǎng)箱中，24小時后數(shù)空斑。 2.6熒光定量PCR檢測MDQ作用后病毒滴度PA317-FLV細胞株，用0.125胰蛋白酶將生長良好的PA317-FLV細胞分散成單個細胞懸液，按1×105個/mL濃度分種于6孔板，每孔1mL，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液

11、，每孔200μL。藥物的終濃度分別為10、20、40mg/L.每種濃度1孔。同時設(shè)陽性藥物AZT對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h。以Trizol提取每孔細胞總RNA，送交本所何金洋老師進行熒光定量RT-PCR法檢測FLV病毒滴度。 2.7激光共聚焦實驗：PA317-FLV細胞于實驗前一天以0.125胰蛋白酶消化后，吸取1ml放入激光共聚焦專用單孔板上，于實驗前一小時，固定，染色細胞，避光半小時，用激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)觀察，激發(fā)波長為48

12、8nm，放射波長為526nm，拍照。在10S時加入以DMSO輔助溶解的MDQ，濃度為1g/l，對照組為加入相同濃度的DMSO溶液，檢測時間為6分鐘。 3.成果3.1體重、脾重、脾指數(shù)及脾臟病理切片：體重：AZT組與MDQ大劑量組比較，AZT脾重較MDQ大劑量輕(P＜0.05)，而體重與MDQ大劑量組無差別；脾重：正常對照組與AZT組的脾臟重量幾乎無差別，MDQ大劑量組也顯示出較好的治療FLV所引起的脾大癥的作用，而MQQ小劑量組

13、與模型組在脾重上幾乎沒有什么差別；脾指數(shù)：AZT組具有最為明顯的減少小鼠脾指數(shù)的作用，其次是MDQ組；從脾臟病理片結(jié)果如下：正常組鏡下觀察：脾組織結(jié)構(gòu)清晰，脾小節(jié)結(jié)構(gòu)完整，紅、白髓相間分布，邊緣區(qū)中邊緣竇清楚。模型組鏡下觀察：脾組織結(jié)構(gòu)完全破壞，脾小節(jié)萎縮以至無脾小節(jié)；紅髓血竇擴張充血似血湖，各處見瘤細胞呈密集成片彌漫浸潤，有的區(qū)域瘤細胞互相連接形成網(wǎng)狀，有的排列稀疏，細胞間有一定間隔。瘤細胞形態(tài)較一致，呈圓形、橢圓形、漿少、淡染、核膜

14、清晰，染色質(zhì)粗點彩狀，核仁不明顯，未見核分裂。AZT組，在髓竇中可見少量腫瘤細胞浸潤，紅白髓結(jié)構(gòu)完整，脾小梁結(jié)構(gòu)完整，MDQ大劑量組，紅白髓結(jié)構(gòu)完整，紅白髓中有少量腫瘤細胞浸潤；MDQ中劑量組，紅白髓結(jié)構(gòu)破壞明顯，紅白髓中、髓竇中有大量腫瘤細胞浸潤；MDQ小劑量組，脾臟結(jié)構(gòu)基本破壞，大量腫瘤細胞彌漫浸潤其間。 3.2CD4T、CD8T、CD4T/CD8T：MDQ大劑量組與AZT組相較于模型組表現(xiàn)出了升高CD4T細胞值的作用，其中

15、AZT的作用較MDQ組顯著(兩組間比較，P＜0.05)；各組之間CD8T細胞值差異不大；CD4T/CD8T值仍以AZT組為最為理想，但MDQ大劑量組也表現(xiàn)出升高CD4T/CD8T值的作用。 3.3IL-1β，IL-2，IL-6及INF-γ在本實驗中所測的小鼠IL-1的濃度按照下列順序排列：造模組、AZT組、MDQ大劑量組、MDQ中劑量組、MDQ小劑量組、正常組。其中MDQ大、MDQ中、和AZT組與模型組有差異(P＜0.05)；I

16、L-2其順序基本為：正常組、MDQ大劑量組、AZT組、MDQ中劑量組、MDQ小劑量組、造模組。 3.4空斑實驗結(jié)果：MDQ有降低FLV-PA317所產(chǎn)生病毒毒力作用。 3.5熒光定量PCR檢測病毒滴度MDQ有降低FLV-PA317所產(chǎn)生病毒滴度作用。 3.6激光共聚焦實驗：細胞在實驗開始時的鈣離子濃度在58-68這一范圍內(nèi)。10S時加入MDQ后有一小幅鈣離子內(nèi)流增加，但隨時間推移在100S時開始，鈣離子內(nèi)流速度持

17、續(xù)而緩慢地降低，在550S左右鈣離子內(nèi)流的水平保持在42-45左右，直到實驗結(jié)束。而對照組所采用的是溶劑DMSO，未發(fā)現(xiàn)有鈣離子內(nèi)流變化出現(xiàn)。 四、結(jié)論：4.1MDQ具有治療FLV所導(dǎo)致的小鼠白血病的作用，表現(xiàn)在其具有減小由于感染FLV所導(dǎo)致的小鼠的脾大癥、保護小鼠脾臟由于受到FLV作用而產(chǎn)生的病理損傷、升高CD4T細胞數(shù)量。 4.2.MDQ治療FLV所導(dǎo)致小鼠白血病機制可以在于，通過節(jié)全身免疫系統(tǒng)機能，抑制針對病毒的免