1、研究背景
　　 糖尿病已經(jīng)成為全球的公共健康問題，在中國(guó)，有9200多萬人患有糖尿病，其中2型糖尿病占90%以上。目前已知的2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制一方面是β細(xì)胞難以補(bǔ)償胰島素抵抗效應(yīng)，另外一方面是β細(xì)胞數(shù)量減少，β細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損導(dǎo)致血糖難以控制及糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。尋找一種能夠減弱β細(xì)胞功能衰竭和/或提高分泌胰島素細(xì)胞的數(shù)量的方法很有必要。恢復(fù)胰島功能是醫(yī)學(xué)界所期待和研究的方向。干細(xì)胞具有中、外胚層多向組織分化的能力，對(duì)于

2、臨床應(yīng)用來說，骨髓干細(xì)胞很容易獲取，因?yàn)樗泻芏喔杉?xì)胞類型，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞，它對(duì)改善β細(xì)胞生存和再生很有幫助。目前有大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病有很好治療效果。目前利用自體骨髓干細(xì)胞對(duì)2型糖尿病的治療進(jìn)入了臨床應(yīng)用前的研究階段，采用自體骨髓干細(xì)胞移植的方法，將自體骨髓來源干細(xì)胞經(jīng)血管介導(dǎo)注入體內(nèi)以分化成新的胰島樣細(xì)胞，有望控制病情變化甚至治愈糖尿病。
　　 基于以上認(rèn)識(shí)，我們開展了本項(xiàng)目研究，我們對(duì)自體骨髓間

3、充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)；把分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不經(jīng)任何誘導(dǎo)處理經(jīng)血管介入定向移植到胰腺，觀察移植后患者的血糖控制情況、胰島功能及糖化血紅蛋白的變化，以及觀察是否存在不良反應(yīng)。從臨床角度上研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T2DM胰島功能修復(fù)的能力，改善血糖控制的效果以及可能的不良反應(yīng)。
　　 第一部分：成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定
　　 目的：建立成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離

4、、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定的方法，并分析其生物特性，為進(jìn)一步深入研究提供理論依據(jù)。
　　 方法：采取擬行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的2型糖尿病患者的骨髓200ml，經(jīng)人類骨髓干細(xì)胞體外分離純化試劑盒分離提取骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，在含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞具有貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，經(jīng)過不斷更換細(xì)胞培養(yǎng)液從而不斷純化分離BM-MSCs，并行體外擴(kuò)增與培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)情況。描

5、繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線了解其生長(zhǎng)特性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD44、CD45以及CD90的表面分子標(biāo)記的表達(dá)情況。臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定其活性。
　　 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞均呈梭形外觀，細(xì)胞間成平行、漩渦狀排列。原代細(xì)胞接種1-2天內(nèi)觀察出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，5-9天細(xì)胞增殖速度增快，第10-12天時(shí)細(xì)胞融合成單層；傳代細(xì)胞在3-6天增殖速度最快，第7-10天達(dá)到平臺(tái)期。細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90表達(dá)陽性，CD34、CD

6、45表達(dá)陰性。臺(tái)盼藍(lán)染色活性鑒定大于95%。
　　 第二部分：自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)2型糖尿病的安全性及療效評(píng)價(jià)
　　 目的：研究自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病的臨床應(yīng)用價(jià)值，評(píng)價(jià)對(duì)2型糖尿病的治療效果，初步探討自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病的機(jī)制。
　　 方法：選取第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院內(nèi)分泌科住院符合納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)的共18例患者，獲得知情同意書后接受自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療。①粒細(xì)胞集落刺激

7、因子動(dòng)員骨髓；②患者俯臥位腰麻，雙側(cè)髂后上棘多點(diǎn)穿刺，抽取骨髓血200ml，將采集的骨髓血進(jìn)行干細(xì)胞分離；③經(jīng)腹股溝動(dòng)脈插管將干細(xì)胞注入胰背動(dòng)脈和/或胰橫動(dòng)脈；④觀察患者移植前及移植后FPG(空腹血糖)、2h-PG小時(shí)(餐后2小時(shí)血糖)、F-CP(空腹C肽)、2h-CP(餐后2小時(shí)C肽)、AUCC(C肽曲線下面積)、HbAlc(糖化血紅蛋白)、BMI(體重指數(shù))等指標(biāo)的變化，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析。同時(shí)觀察有無并發(fā)癥及不良反應(yīng)。
　　

8、 結(jié)果：18例患者(12男6女)，其中8例患者進(jìn)行3月隨訪，5例患者進(jìn)行6月隨訪，5例患者進(jìn)行12月隨訪。①自體骨髓干細(xì)胞移植過程中及術(shù)后隨訪均未觀察到不良反應(yīng)，移植前后腫瘤標(biāo)志物及血淀粉酶均正常；②術(shù)后隨訪3月、6月、12月隨訪糖化血紅蛋白(HbAlc)較移植前不同程度下降，其中3月、6月統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異；3月、6月、12月空腹C肽(FC-P)及餐后2小時(shí)C肽(2hC-P)較移植前不同程度上升?？崭笴肽升高達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3月、6

9、月、12月隨訪時(shí)與治療前相比AUCC升高(5.93±5.85vs7.26±5.73，3.8±1.6vs5.8±2.38，4.73±5.32vs7.64±4.68)。有1例患者在術(shù)后第一日出現(xiàn)低顱壓綜合征，平臥休息后臨床癥狀緩解，無特殊不適。
　　 結(jié)論
　　 1.人類骨髓干細(xì)胞體外分離純化試劑盒分離的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的細(xì)胞純度高，擴(kuò)增能力強(qiáng)。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)的BM-MSCs高度表達(dá)CD4