1、目的：肝細胞肝癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易侵襲轉(zhuǎn)移，預后差，因而探索肝細胞癌的發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移機制是臨床研究的一大挑戰(zhàn)。肝癌生長速度快，造成局部組織嚴重缺氧，缺氧狀況下中腫瘤仍能不斷增殖，浸潤，極易侵襲轉(zhuǎn)移和復發(fā)，這也是肝癌研究的重點及臨床治療的難點，但肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚。此過程中起關鍵作用的是缺氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor-1 HIF-1)。HIF-1 是迄今為止發(fā)

2、現(xiàn)的唯一一個特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1 α在腫瘤組織中廣泛表達，對維持腫瘤細胞的能量代謝、腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移起重要作用。本研究通過應用HIF-1 α抑制劑YC-1和HIF-1 α的反義寡核苷酸分別處理SMMC-7721肝癌細胞，觀察不同藥物濃度對肝癌細胞增殖的作用和對SMMC-7721細胞周期及凋亡率的影響，榆洲bc1-2，bax，survivin mRNA和蛋白表達量的變化，明確缺氧誘導因子-1

3、對肝癌細胞周期和增殖調(diào)亡影響及可能機制，為明確肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制及采取相應的治療措施提供理論依據(jù)。 方法：肝癌細胞系SMMC-7721分對照組和試驗組。對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)，試驗組細胞分別施加HIF-1 α抑制劑YC-1和HIF-1 α的反義寡核苷酸干預，設濃度梯度和時間梯度。MTT 方法檢測不同藥物濃度對SMMC-7721細胞的增殖的作用；采用FCM檢測不同時間點、不同藥物濃度對SMMC-7721細胞周期和凋亡率的影響；采用逆轉(zhuǎn)

4、錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，測定細胞bc1-2，bax，survivin mRNA表達的變化，以β-actin作為內(nèi)參照標準，通過凝膠掃描儀對擴增產(chǎn)物進行DNA電泳條帶的光密度值分析，將bc1-2，bax，survivin與β-actin比值作為bc1-2，bax，survivin mRNA表達水平的參數(shù)，對bc1-2，bax，survivin產(chǎn)物相對定量；以Western blot方法檢測SMMC-7721細胞胞漿bc1-

5、2，bax，survivin蛋白表達的變化，同樣以β-actin作為內(nèi)參照標準，對bc1-2，bax，survivin蛋白進行相對定量分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(GLM過程)檢驗，P<0.05為有顯著差異。 結果: 1. MTT比色法顯示： 1.1 YC-1對SMMC-7721細胞增殖具有抑制作用。不同濃度YC-1處理細胞后，與對照組相比，各處理組OD值均有顯著下降

6、，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。YC-1處理細胞不同時間后，與對照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨YC-1處理濃度的增大、作用時間的延長，OD值顯著下降，即YC-1對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用呈明顯的時間-劑量依賴效應，(P<0.05)(Fig.2，Table 1)。 1.2 HI

7、F-1 α的ASODN對SMMC-7721細胞增殖具有抑制作用。不同濃度ASODN處理細胞后，與對照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。HIF-1 a的ASODN處理細胞不同時間后，與對照組相比，各處理組OD值均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨ASODN處理濃度的增大、作用時間的延長，OD值顯

8、著下降，即ASODN對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用呈明顯的時間-劑量依賴效應(Fig.3，Table 2)(P<0.05)。 2. 流式細胞儀檢測細胞周期分布顯示： 2.1 不同濃度YC-1處理細胞后，與對照組相比，各處理組G0/G1期細胞增多(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)，G2/M期細胞變化不明顯(P>0.05)。各實驗組問比較，差異辦具有顯著性(P<0.05)。YC-1處理細胞不同時間后，與對

9、照組相比，各處理組G0/G1期細胞增多(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)，G2/M期細胞變化不明顯(P>0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。即YC-1可阻滯SMMC-7721細胞周期進程于G0/G1期，該作用呈時間-劑量依賴效應(Fig 5、9，Table 3、4)。隨YC-1濃度的增大和時間的延長，凋亡百分率逐漸升高(Fig.6，Table 7)，(P<0.05)；(Fig.10，Table 9)

10、，(P<0.05)，呈時間-劑量依賴效應。 2.2 不同濃度HIF-1 α的ASODN處理細胞后，與對照組相比，各處理組GO/G1期細胞增多(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)，G2/M期細胞變化不明顯(P>0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。HIF-1 α的ASODN處理細胞不同時間后，與對照組相比，各處理組GO/G1期細胞增多(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)，G2/M期細胞變

11、化不明顯(P>0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。即ASODN可阻滯SMMC-7721細胞周期進程于G0/G1期，該作用呈時間-劑量依賴效應(Fig.7、11，Table 5、6)。隨ASODN濃度的增大和時間的延長，凋亡百分率升高(Fig.4，Table 8)，(P<0.05)；(Fig.8，Table 10)，(P<0.05)，呈時間-劑量依賴效應。 3. PCR結果顯示： 3.1 不同濃度

12、YC-1處理細胞不同時間后，與對照組相比，各實驗組bcl-2 mRNA和survivin mRNA表達均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)，各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(P>0.05)。隨YC-1濃度的增大和時間的延長，SMMC-7721細胞bcl-2 mRNA(Fig.12、14，Table 11)和survivin mRNA(Fig.20、22，Table 13)表達顯著

13、下降，均呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(Fig.16、18，Table 12)(P>0.05)。 3.2 不同濃度HIF-1 a的ASODN處理細胞不同時間后，與對照組相比，各實驗組bc1-2 mRNA和survivinmRNA表達均有顯著下降，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(P>0.05)。隨HIF-

14、1 a 的ASODN濃度的增大和時間的延長，bc1-2 mRNA(Vig.13、15，Table 14)和survivin mRNA(Fig.21、23，Table 16)表達顯著下降，均呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)。而bax的mRNA無明顯變化趨勢(Fig.17、19，Table 15) (P>0.05)。 4. Western結果顯示： 4.1 不同濃度YC-1處理細胞不同時間后，與對照組相比，各實驗組b

15、c1-2和survivin的蛋白表達顯著下降，bax的蛋白表達顯著增加，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組間比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨YC-1濃度的增大和時間的延長，SMMC-7721細胞bc1-2(Fig.24、26，Table i4)和 survivin(Fig.33、35，Table 22)蛋白表達顯著下降，bax的蛋白顯著增加(Fig.29、31，Table 18)，均呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05

16、)。 4.2 不同濃度HIF-1 a 的ASODN處理細胞不同時間后，與對照組相比，各實驗組bc1-2，survivin的蛋白表達逐漸減少，bax的蛋白逐漸增加，差異具有顯著性(P<0.05)。各實驗組問比較，差異亦具有顯著性(P<0.05)。隨HIF-1 a的ASODN濃度的增大和時間的延長，bc1-2(Fig.25、27，Table 17)和 survivin(Fig.32、34，Table 19)蛋白表達顯著下降，bax的

17、蛋白顯著增加(Fig.28、30，Table 21)，均呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)。 結論: 1. 通過MTT法證實了YC-1和HIF-1α的ASODN具有對SMMC-7721肝癌細胞株增殖抑制作用，呈明顯的時間-劑量依賴效應，為肝癌的綜合治療提供了新的選擇。 2. 通過對細胞周期的測定，證明YC-1和HIF-1α的ASODN可以阻滯肝癌細胞于G0/G1期，抑制細胞增殖，影響細胞周期進程，作用呈明顯

18、的時間-劑量依賴效應。 3. 通過對細胞凋亡率的測定，證明YC-1和HlF-1α的ASODN可以誘導肝癌細胞的調(diào)亡，凋亡率隨藥物濃度增大和作用時間的延長增高，且呈明顯的時間-劑量依賴效應。 4. HIF-1α促進增殖抑制凋亡的機制是上調(diào)肝癌細胞Survivin和bcl-2的表達，下調(diào)bax的表達。這種作用呈明顯的時間-劑量依賴效應。 5. 針對HIF-1α的抑制劑和反義寡核苷酸的應用，為肝癌的治療提供了新的思路.