1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種發(fā)病率較高的關(guān)節(jié)疾病,以軟骨退變和軟骨下骨異常改建為主要病理表現(xiàn)。顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibularjoint,TMJ)是OA好發(fā)部位之一。骨性關(guān)節(jié)炎所造成的軟骨退變,采用傳統(tǒng)治療方法很難自行完善修復(fù),而骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有較強的自我更新能力和多向分化潛能,在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為軟骨細胞。本實驗以本課題組

2、所建的咬合紊亂致小鼠髁突軟骨退行性變模型為研究對象,評價外源性BMSCs向病變髁突軟骨遷移、定植、分化的特征。
　　實驗方法與結(jié)果
　　1.實驗性單側(cè)前牙反牙合致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突骨關(guān)節(jié)炎樣變動物模型的建立:
　　將第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供的60只6周齡雌性C57BL6小鼠,隨機、等量分為空白對照組和實驗組。實驗組小鼠左側(cè)上、下前牙粘接統(tǒng)一規(guī)格金屬不良修復(fù)體,造成左側(cè)前牙反牙合的異常咬合接觸。對照組小鼠進行對照操作

3、,給予同樣的飼養(yǎng)環(huán)境至實驗結(jié)束。實驗組和對照組在實驗室開始后3w處死動物,取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)后常規(guī)脫鈣,石蠟包埋,進行HE、甲苯胺藍染色以及形態(tài)學(xué)的測量。HE染色顯示,對照組髁突軟骨表面光滑連續(xù),細胞排列整齊。實驗組髁突軟骨出現(xiàn)明顯退變,表現(xiàn)為軟骨厚度變薄,軟骨細胞數(shù)目減少,細胞排列紊亂,個別出現(xiàn)明顯的無細胞區(qū);甲苯胺藍染色顯示的蛋白多糖表達明顯低于對照組;軟骨下骨的骨體積分數(shù)和骨小梁厚度明顯低于對照組,骨小梁間隙高于對照組(P<0.0

4、5)。
　　2.TMJ髁突軟骨誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化的實驗研究:
　　首先,將GFP-BMSCs分為三組,兩個共培養(yǎng)組和一個單獨培養(yǎng)組。共培養(yǎng)組實驗組(OATMJ)和對照組(TMJ)髁突軟骨組織塊放在膜孔8μm的transwell小室上層,GFP-BMSCs接種在小室的下層,分別于共培養(yǎng)后3、7、14、21d收集下室GFP-BMSCs。單獨培養(yǎng)組的GFP-BMSCs于相應(yīng)的時間點進行收集。用Trizol法提取兩個共培養(yǎng)

5、組GFP-BMSCs和單獨培養(yǎng)組GFP-BMSCs總RNA,采用RealTimePCR定量分析COLII基因的含量。其次,分別取兩個共培養(yǎng)組以及單獨培養(yǎng)組的GFP-BMSCs、原代軟骨細胞進行細胞爬片,行甲苯胺藍和免疫熒光化學(xué)染色。結(jié)果顯示,與髁突軟骨共培養(yǎng)的GFP-BMSCs表達COLII,明顯高于單獨培養(yǎng)的GFP-BMSCs(P<0.05),實驗組和對照組沒有明顯差異(P>0.05)。
　　3.TMJ髁突軟骨誘導(dǎo)GFP-BMS

6、Cs定向遷移的離體實驗研究:
　　采用膜孔徑8μm的transwell小室鑒定GFP-BMSCs的遷移,取造模3w的實驗組和同齡對照組髁突軟骨組織塊放在小室的下層,上層接種GFP標記BMSCs,24h后,對小室上層進行DAPI染色,觀察從上層上面遷移到上層下面的細胞數(shù);7d,行甲苯胺藍染色;21d后,將transwell下室的TMJ進行常規(guī)包埋,行HE、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)染色。24h,DAPY染色顯示,實驗組遷移的細胞數(shù)量

7、多于對照組(P<0.05);7d甲苯胺藍染色顯示,無論是實驗組還是對照組,髁突軟骨以及髁突軟骨附近的GFP-BMSCs均呈藍紫色,而遠離髁突軟骨GFP-BMSCs不著色;21dHE染色顯示,實驗組髁突軟骨內(nèi)有大量的異質(zhì)性的細胞核,對照組髁突軟骨中未見此現(xiàn)象;GFP免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色均顯示,實驗組髁突軟骨GFP表達陽性,而對照組髁突軟骨未見表達GFP表達。
　　4.外源性BMSCs注射于TMJ區(qū)域后生物發(fā)光技術(shù)示蹤觀察:

8、
　　采用熒光素酶慢病毒轉(zhuǎn)染GFP-BMSCs,獲得持續(xù)穩(wěn)定表達熒光素酶的LUC-BMSCs。在造模3w的小鼠右側(cè)TMJ區(qū)域,注射LUC-BMSCs(1x108/ml)25μl,左側(cè)注射等量的生理鹽水,在成像系統(tǒng)下縱向動態(tài)觀察28d內(nèi)信號的變化。LUC-BMSCs持續(xù)穩(wěn)定表達熒光素梅,且表達量與細胞數(shù)量呈線性相關(guān)。LUC-BMSCs注射小鼠TMJ區(qū)域后,實驗組小鼠顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)域生物發(fā)光的信號強度從1.537×106P?s-1?cm

9、-1?sr-1起持續(xù)升高,到7d時達到峰值(3.997×106P?s-1?cm-1?sr-1)之后逐漸降低,到28d時信號強度降低到1.797×104P?s-1?cm-1?sr-1。
　　5.TMJ局部注射外源性BMSCs治療TMJOA的組織學(xué)評價:
　　取6周齡C57BL6小鼠60只,隨機、等量分為空白對照組和實驗組。造模3w后,每周在實驗組和對照組的小鼠右側(cè)顳頜關(guān)節(jié)區(qū)域注射濃度為1x108/ml的GFP-BMSCs25μ

10、l,左側(cè)注射鹽水25μl。分別在注射GFP-BMSCs后4w、8w、12w處死,取出雙側(cè)髁突,多聚甲醛固定,石蠟包埋,行HE、免疫組織化學(xué)染色。HE染色結(jié)果顯示,相同時點,實驗組注射GFP-BMSCs髁突軟骨厚度明顯高比注射生理鹽水側(cè)的髁突軟骨厚度(P<0.05);12w,實驗組注射GFP-BMSCs側(cè)髁突軟骨厚度與對照組髁突軟骨無明顯差異(P>0.05);免疫組化染色顯示實驗組髁突軟骨內(nèi)有GFP陽性表達,而對照組髁突軟骨內(nèi)未見到GFP