1、目的：復(fù)制衰老是正常人體細(xì)胞在體外分裂潛能受限制的現(xiàn)象，是細(xì)胞的一種存在形式，在眼部可能與多種年齡相關(guān)性疾病有關(guān)。本研究目的是觀察一定波長下不同強(qiáng)度的藍(lán)光對(duì)培養(yǎng)人(RPE)細(xì)胞中衰老相關(guān)β一半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性的作用，及不同濃度的維生素E(VitE)對(duì)復(fù)制衰老細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究老年性黃斑變性(AMD)等眼部病變與復(fù)制衰老的關(guān)系提供依據(jù)。 方法：1.人RPE細(xì)胞的體外培養(yǎng)以因意外死亡的新鮮人眼球?yàn)椴牧希捎靡鹊?/p>

2、白酶消化法進(jìn)行RPE細(xì)胞的原代培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)，以免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。待細(xì)胞基本融合后，將細(xì)胞以1:2～1:3傳代，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每4～7天傳代，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，描記生長曲線。2.藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞復(fù)制衰老和VitE的作用取生長良好的人RPE細(xì)胞，自第2代開始在培養(yǎng)液中加入VitE，使不同分組培養(yǎng)液中VitE終濃度分別為100μmol/L、50μmol/L、10μmol/L和

3、0；給予波長450nm～500nm，細(xì)胞表面水平光照度分別為(2000±500)lux、(1000±200)lux、(500±100)lux和0的分組光照，每天光照1小時(shí)。在此基礎(chǔ)上各組細(xì)胞正常培養(yǎng)傳代至第5代，并觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。將不同光照處理后的第5代細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)，固定30分鐘，0.1％TritonX-100室溫下作用20分鐘，加入SA-β-Gal檢測液，室溫、避光，顯色24小時(shí)，高倍鏡下觀察細(xì)胞中是否有藍(lán)

4、色顆粒的表達(dá)；將各組不同光照強(qiáng)度處理后的細(xì)胞接種于96孔板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入DMSO150μl，微型振蕩器振蕩10分鐘，600nm測定光密度(opticaldensity，OD)值。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件后進(jìn)行雙因素方差分析，用SNK法進(jìn)行多重比較。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.人RPE細(xì)胞形態(tài)特征原代細(xì)胞24～48小時(shí)后基本能夠

5、貼壁并變得扁平，4～5天后貼壁細(xì)胞會(huì)伸出偽足，呈不規(guī)則多角形，中央的圓形透明區(qū)域?yàn)榧?xì)胞核，可見到處于分裂期的雙核和多核細(xì)胞以及呈集落生長的細(xì)胞團(tuán)。免疫組織化學(xué)檢測呈陽性反應(yīng)，胞漿被染成棕黃色。5～10天原代細(xì)胞基本融合。隨傳代次數(shù)增加，胞漿中的黑色素顆粒逐漸減少，漸趨于透明。復(fù)制衰老人RPE細(xì)胞體積增大，胞體變平，多數(shù)細(xì)胞失去多角形態(tài)，長的細(xì)胞突起增多。經(jīng)SA-β-Gal活性染色，復(fù)制衰老細(xì)胞被染成淡藍(lán)色。2.藍(lán)光誘導(dǎo)復(fù)制衰老及VitE

6、的抑制復(fù)制衰老作用SA-β-Gal活性檢測：隨光照強(qiáng)度增加和VitE濃度降低，細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率升高。不同光照強(qiáng)度之間F=20.76(P<0.01)，各光照強(qiáng)度作用效果差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：不同VitE濃度之間F=16.76(P<0.01)，各濃度作用效果除10μmol/L組與無VitE組(P>0.05)外差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTT檢測：隨光照強(qiáng)度增加和VitE濃度降低，細(xì)胞增殖能力有降低趨

7、勢。不同光照強(qiáng)度之間F=10.26(P<0.01)，其中(2000±500)lux、(1000±200)lux、(500±100)lux三組0D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，無光照組OD值和這三組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同VitE濃度之間F=27.27(P<0.01)，各濃度作用效果除100μmol/L組與50μmol/L組(P>0.05)外差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：1.應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)的