1、目的:糖尿病影響骨代謝，誘發(fā)糖尿病性骨病。胰島素受體底物1(insulinreceptor substrate1，IRS1)是胰島素信號轉導通路中受體后水平的重要信號蛋白。研究發(fā)現(xiàn)IRS1不僅促進骨形成，而且影響骨吸收，IRS1主要作用于成骨細胞影響骨轉換，但機制尚不完全清楚。抑制成骨細胞NFκ B(nuclear factor kappa-B，NFκB)通路增強成骨細胞分化、礦化和骨形成，但直接調節(jié)成骨細胞NFκB的基因仍需確定。高糖

2、環(huán)境導致凋亡蛋白BAX(Bcl2-associated X protein，BAX)表達增加。研究發(fā)現(xiàn)IRS1具有抗凋亡能力，但IRS1如何調控成骨細胞BAX尚不清楚。
　　糖尿病影響骨代謝，誘發(fā)糖尿病性骨病。1型糖尿病病人骨密度降低，2型糖尿病病人骨密度正常、升高或降低。試驗證據(jù)清楚表明無論1型還是2型糖尿病病人骨折風險性均增加。糖尿病病人骨折風險性增加與成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收不平衡相關。多種機制參與糖尿病性骨病的發(fā)生。

3、胰島素和IGF1信號通路在糖尿病發(fā)揮重要作用，且與骨代謝密切相關。研究報導糖尿病病人骨量和胰島素劑量、尿C肽呈正相關，外源性和內源性胰島素可能影響糖尿病病人骨代謝平衡。胰島素和IGF1通過經(jīng)典細胞內信號轉導途徑影響骨代謝，下游IRS1/2、Akt(Protein Kinase B，Akt)和MEK(MAPK/ERK kinase，MEK)作用機制尚不清楚。除經(jīng)典途徑外，胰島素和IGF1可能通過成骨細胞Wnt(wingless-int)和

4、BMP2(bonemorphogenic protein2)通路促進骨骼發(fā)育。胰島素直接影響成骨細胞代謝。體外研究發(fā)現(xiàn)生理劑量胰島素促進成骨細胞增殖、膠原合成、堿性磷酸酶產生，目前仍不完全清楚胰島素促進骨形成機制。胰島素促進成骨細胞發(fā)育和骨鈣素表達，骨鈣素參與骨礦化和鈣離子的動態(tài)平衡。IGF1通過自分泌和旁分泌方式促進成骨細胞樣細胞增殖、分化和細胞外基質產生，促進骨形成。青春期時期，IGF1決定長骨生長、骨骼發(fā)育和骨量增加，成年階段維持

5、骨量。IGF1增加成骨細胞數(shù)目和活性以增加骨形成;抑制破骨細胞分化以減少骨吸收。
　　IRS1是胰島素和IGF1信號通路重要靶分子，且對維持正常骨代謝有重要意義。IRS1基因敲除小鼠骨形成和骨吸收均減少。IRS1基因自發(fā)性突變影響成年后骨骼表型，表現(xiàn)為高胰島素血癥及低骨密度等。IRS1基因敲除小鼠骨折難愈合提示IRS1參與骨修復，而且其作用不能被IRS其他亞型和IGF通路替代。IRS1缺陷小鼠骨愈合受損，這種受損在IRS1重新表達

6、后恢復。IRS1主要經(jīng)成骨細胞調節(jié)骨轉換，其中機制仍不完全清楚。大量體外研究已證明IGF1和IRS/PI3K/Akt通路促進成骨細胞骨分化。抑制IRS1減少成骨細胞壽命、增殖、礦化和分化。IRS1通過促進前成骨細胞增殖和分化增加骨形成，產生更多膠原增加骨基質;IRS1不僅促進骨形成和礦化，也經(jīng)由MMPs(matrix metallopeptidases，MMPs)和RANKL/TNFRSF11B(tumor necrosis facto

7、r receptor superfamily, member11b)比率影響骨吸收，最終調節(jié)骨循環(huán)。此外，予以IRS1干擾RNA抑制RUNX2(runt-relatedtranscriptionfactor2,RUNX2)、ALP(alkalinephosphatase, ALP)和BSP(bone sialoprotein, BSP)表達。
　　PI3K/Akt通路與骨代謝關系密切。越來越多證據(jù)表明許多信號分子在骨發(fā)揮其特異性效

8、應通過選擇性激活成骨細胞PI3K/Akt通路。此外PI3K/Akt可以與其他信號通路和基因調控網(wǎng)絡共同調控骨細胞發(fā)育，也有證據(jù)表明PI3K/Akt信號通路失控可能與某些骨骼病變相關。激活PI3K/Akt通路促進成骨細胞增殖。高糖誘導的氧化應激激活PI3K/Akt通路抑制成骨分化。破骨細胞產生趨化因子SIP(Sphingosine-1-Phosphate,S1P)激活PI3K/Akt信號通路，導致成骨細胞分化標記物包括堿性磷酸酶表達上調，

9、并促進成骨細胞遷移。破骨細胞分泌骨吸收介質通過PI3K/Akt信號通路促進成骨細胞前體細胞分化和鈣化。HGF(Hepatocyte growthfactor，HGF)激活PI3K/Akt信號通路，增加骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)表達調控骨礦化。在成骨細胞和鈣化血管平滑肌細胞，Xie H等發(fā)現(xiàn)omentin1激活PI3K/Akt信號通路激活OPG和抑制RANKL產生，減輕OPG-/-小鼠動脈鈣化和骨質流失。Akt磷酸化抑制糖

10、皮質激素誘導的成骨細胞凋亡。胰島素依賴型糖尿病通過抑制Akt，減弱骨形成。激活Akt，增加破骨細胞形成和增強破骨細胞分化。Akt蛋白家族有3個亞型:Akt1，Akt2和Akt3。Akt1和Akt2均在成骨細胞和破骨細胞大量表達，除了Akt3。雖然Akt蛋白單亞型敲除小鼠表現(xiàn)出溫和的表型，但是Akt1和Akt2都敲除小鼠出現(xiàn)嚴重骨骼發(fā)育受損和侏儒癥。Akt1促進成骨細胞和破骨細胞分化和存活，Akt1缺陷抑制成骨細胞RANKL表達，引起破骨

11、細胞自主功能障礙，損害骨吸收功能。Akt1和Akt2都敲除下調RANKL誘導的NFκB p50的DNA結合能力，抑制破骨細胞分化。
　　NFκB與骨代謝密切相關。由RANKL（nuclear factor kB ligand，RANKL）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）或者白介素1（interleukin1，IL1）激活的NFκB信號通路能夠誘導破骨分化基因表達，延長破骨細胞壽命，增加骨吸收。成

12、骨細胞NFκB活性降低時，JNK活性增強，導致骨形成增強。抑制NFκB通路可以逆轉TNFα抑制的成骨細胞分化。Julien M等發(fā)現(xiàn)在成熟成骨細胞NFκB通過一系列信號轉導抑制成骨細胞礦化。體外抑制成骨細胞NFκB信號通路，增強了成骨細胞礦化，但是破骨細胞數(shù)量沒有改變。NFκB激活導致成骨細胞釋放IL6，成骨細胞釋放IL6導致破骨細胞激活。但直接調節(jié)成骨細胞NFκB的基因仍需確定。
　　研究發(fā)現(xiàn)凋亡可能是骨質疏松癥第三大常見原因，

13、估計60～80％成骨細胞正處于凋亡。成骨細胞凋亡增加松質骨生成。Bcl2(B-cell lymphoma2，Bcl2)家族長久以來被認為是凋亡主要調節(jié)機制，其中Bcl2抑制凋亡，BAX促進凋亡，二者獨立調節(jié)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠凋亡顯著增加。糖尿病時，高糖環(huán)境引起細胞損傷，BAX激活和引起其他促凋亡蛋白如細胞色素C釋放。1型糖尿病小鼠骨中成骨細胞凋亡增加。一些研究表明IRS1具有抗凋亡能力，IRS1可通過調節(jié)Bcl2調控凋亡。

14、　　本研究組前期試驗顯示2型糖尿病合并骨質疏松癥的發(fā)病可能與骨組織IGF1、IRS1、IRS2表達受抑制有關，同時可能與骨組織PI3K、Akt表達降低、NFκB表達升高有關。
　　本研究通過構建pEGFP-N1-IRS1表達載體，轉染體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞，同時給予PI3K激酶特異性抑制劑LY294002，觀察在有或無LY294002條件下成骨細胞NFκB、BAX表達變化及成骨細胞細胞周期變化，為闡明糖尿病骨病的發(fā)生機制提供一條新

15、思路。
　　方法:
　　第一部分:提取Wister大鼠肝臟RNA，逆轉錄生成cDNA。根據(jù)NCBI提供的IRS1基因編碼序列，委托DNA合成公司合成帶適當酶切位點的引物，以cDNA作為模板合成IRS1，插入pEGFP-N1質粒，獲得過表達IRS1的表達載體。體外轉染人Hela細胞。
　　第二部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細胞，倒置顯微鏡下觀察成骨細胞形態(tài)，傳代至第二代時茜素紅染色鑒定成骨細胞。傳代

16、至第二代時pEGFP-N1-IRS1表達載體脂質體法LipofectamineTM2000瞬時轉染成骨細胞，同時應用PI3K激酶特異性抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt通路，免疫熒光和Western blotting法觀察成骨細胞NFκB表達變化。
　　第三部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細胞，傳代至第二代時pEGFP-N1-IRS1脂質體法LipofectamineTM2000瞬時轉染成骨細胞，同時應

17、用LY294002阻斷PI3K/Akt通路，觀察成骨細胞IRS1/PI3K/Akt通路及BAX的表達變化。同時檢測成骨細胞細胞周期。
　　結果:
　　第一部分:構建質粒經(jīng)核酸內切酶酶切分析、PCR分析初步判斷重組質粒中所插入的片段與預期長度一致。經(jīng)過測序鑒定，合成的IRS1序列與登錄在GenBank上的大鼠IRS1基因序列(GenBank登錄號:NM_012969.1)高度同源，測序結果發(fā)現(xiàn)3個堿基與已發(fā)表的IRS1序列不同

18、:NM_012969.1的第414、1824、2631位堿基分別是C、C和A，而合成的IRS1片段這3個堿基突變?yōu)門、T和G，但合成的IRS1序列翻譯的蛋白質和NM_012969.1翻譯的蛋白質一致。熒光顯微鏡下IRS1-GFP融合蛋白在Hela細胞成功表達。
　　第二部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細胞，經(jīng)HE染色和茜素紅染色證明成骨細胞培養(yǎng)成功。熒光顯微鏡下IRS1-GFP融合蛋白在成骨細胞成功表達;RT-

19、PCR結果表明IRS1表達載體轉染組IRS1 mRNA表達水平明顯增高;Western blotting結果顯示IRS1組pAktThr308蛋白水平相對對照組顯著增加，LY294002阻斷這種作用。免疫熒光和Western Blotting結果均表明IRS1組NFκB p65蛋白水平相對對照組降低，IRS1+LY294002組NFκB p65蛋白表達水平相對IRS1組增加。
　　第三部分:Western Blotting結果表明

20、IRS1組BAX蛋白水平相對對照組顯著降低，IRS1+LY294002組BAX蛋白表達水平相對IRS1組增加。細胞周期分析結果表明IRS1組S期增加，促進細胞增殖;IRS1+LY294002組S期降低。
　　結論:
　　1.成功構建pEGFP-N1-IRS1表達載體，IRS1-GFP融合蛋白在體外成功表達。
　　2.pEGFP-N1-IRS1成功激活成骨細胞PI3K/Akt通路，抑制NFκBp65蛋白表達，PI3K抑制