1、目的：利用PARP—1和p53基因雙缺失的小鼠髓母細胞瘤細胞系，探討DNA損傷修復因子Brca1、Nbs1、Ku70、Ku80和Rad51對小鼠髓母細胞瘤發(fā)生的意義及其相互作用關系。 方法：對PARP—1和p53基因雙缺失的髓母細胞瘤細胞進行原代培養(yǎng)，利用免疫熒光技術鑒定神經(jīng)細胞標志物在髓母細胞瘤細胞系中的表達。采用基因轉染技術用陽離子脂質體介導將PARP—1質粒轉染到小鼠髓母細胞瘤的細胞系與正常對照細胞系中，經(jīng)過有限稀釋法選擇

2、熒光較強的細胞并不斷篩選及克隆化培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達PARP—1熒光蛋白的細胞系。利用Western blot技術檢測髓母細胞瘤細胞系中PARP—1的表達，并觀察計算細胞增殖情況和染色體數(shù)目。然后用RT-PCR和Western blot技術檢測轉染前后腫瘤細胞系和正常細胞系中Brca1、Nbs1、Ku80和Rad51的蛋白或RNA在不同細胞周期的表達，以分析PARP—1對各因子的作用。 結果：所建立的小鼠髓母細胞瘤細胞系，呈多角形

3、、短梭形，免疫熒光分析可見未成熟神經(jīng)元標志性蛋白Vimentin、Dcx、βⅢ-Tubulin等表達陽性，證明該腫瘤細胞的神經(jīng)源性；穩(wěn)定表達PARP—1熒光蛋白的細胞Western blot檢測PARP—1蛋白陽性；對細胞系進行染色體核型分析表明其細胞染色體數(shù)為非整倍體；在不同細胞周期中檢測到DNA雙鏈斷裂損傷修復途徑中的同源重組(HR)修復途徑中的Rad51在細胞周期S期和G2/M期表達量增高，而非同源末端連接(NHEJ)修復途徑中的

4、Ku70、Ku80未發(fā)生明顯變化，DNA損傷修復的早期基因Nbs1也沒有明顯變化；Brca1基因在穩(wěn)定表達PARP—1和PARP—1缺失的髓母細胞瘤(medulloblastoma，MB)細胞系的細胞周期的S期和G2/M期表達增高，且在后者中Brca1表達量更高。 結論：成功建立了PARP—1和p53雙缺失的小腦神經(jīng)源性髓母細胞瘤細胞系和穩(wěn)定表達PARP—1熒光蛋白的髓母細胞瘤細胞系；在PARP—1缺失的髓母細胞瘤細胞系中，DN