1、類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是累及關(guān)節(jié)滑膜的慢性自身免疫性疾病，在我國的患病率約為0.4％，以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。目前的研究顯示RA與T細胞功能異常介導的自身免疫損傷密切相關(guān)，過度活化的T淋巴細胞也是RA免疫病理進程中的重要環(huán)節(jié)。
　　 T細胞活化需要雙信號:第一信號由T細胞受體(TCR)識別抗原提呈細胞(APC)表面的抗原肽-MHC復合物(p-MHC)啟動;

2、第二信號由T細胞和APC間協(xié)同刺激分子的相互作用啟動，B7/CD28是其中最重要的一對協(xié)同刺激分子。近幾年，B7/CD28家族成員不斷擴大，PD-1（Programmed death-1）是一個新近發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子，由PDCD1基因編碼。一系列研究表明，PD-1通過與其兩個配體PD-L1和PD-L2作用而抑制T、B細胞的活化及細胞因子的產(chǎn)生，在維持機體免疫耐受上發(fā)揮至關(guān)重要的作用。同時，PD-1分子也與一系列疾病的免疫病理發(fā)生發(fā)展密切

3、相關(guān)。因此，PD-1分子成為近年來免疫學研究的熱點，有望成為腫瘤、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病的免疫干預治療的有效靶分子。
　　 本課題擬通過檢測 RA患者與骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者，健康對照(Healthy Controls，HC)外周血可溶性PD-1（soluble PD-1，sPD-1）的表達，結(jié)合RA患者臨床分期、臨床癥狀、實驗室指標，探討sPD-1在RA患者中的表達及其功能，通過分析RA患

4、者外周血IFN-γ、IL-4、IL-17A等細胞因子的表達和不同SNP基因型患者sPD-1表達的差異，探討sPD-1在RA患者中異常表達的分子機制。
　　 第一部分可溶性PD-1在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達及其功能的初步研究。
　　 目的:研究可溶性PD-1分子(soluble PD-1，sPD-1)在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達和臨床意義，初步研究sPD-1對PD-1/PD-L1信號通路的影響。
　　 方法:通過

5、本實驗室前期研制的sPD-1分子ELISA檢測試劑盒檢測sPD-1在RA患者外周血中的表達，分析sPD-1與RA患者臨床分期、臨床癥狀、實驗室指標的相關(guān)性;流式細胞術(shù)(FCM)檢測RA患者外周血CD4+T細胞上膜型PD-1(mPD-1)的表達;使用Real Time PCR檢測flPD-1、PD-1Δex3，從mRNA水平驗證mPD-1和sPD-1在RA患者中的表達;通過CCK8檢測細胞增殖的方法研究sPD-1對CD4+T細胞體外增殖的

6、影響。結(jié)果:①RA患者外周血sPD-1的含量為38.39±5.45ng/ml，顯著高于HC(20.56±1.29ng/ml，P=0.0003)和OA(21.88±2.35ng/ml，P=0.0493)，急性活動期患者sPD-1的表達顯著高于慢性緩解期(P=0.0027);②RF陽性RA患者sPD-1的表達明顯高于RF陰性患者(P=0.0491)，sPD-1與RF滴度、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)(r=0.2668，P=0.0411; r=0.43

7、65，P=0.0003);③急性活動期RA患者外周血CD4+T細胞mPD-1的表達明顯高于HC(P＜0.001)和OA(P＜0.001);④mRNA水平RA患者PD-1Δex3的表達明顯高于HC(P=0.0346)和OA(P=0.0401)，與ELISA結(jié)果一致，flPD-1的表達高于HC(P=0.0057)和OA(P=0.0457)，與FCM的結(jié)果一致;⑤PD-L1對CD4+T細胞的體外增殖具有顯著的抑制作用，而這種抑制作用可被sPD

8、-1逆轉(zhuǎn)(P=0.0035)。
　　 結(jié)論:RA患者外周血sPD-1明顯上調(diào)，并與臨床分期、臨床癥狀和預后相關(guān)，sPD-1可干預PD-1/PD-L1信號通路，在RA的免疫病理進程中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分可溶性PD-1在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中異常表達的分子機制的初步研究。
　　 第一節(jié)RA患者外周血細胞因子的表達及與PD-1Δex3的相關(guān)性。
　　 目的:研究T細胞亞群分泌的細胞因子IFN-Υ、IL-

9、4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者中的表達，PD-1Δex3與RA患者失衡的細胞因子的相關(guān)性。
　　 方法:ELISA檢測T細胞體外活化各時相IFN-γ、IL-4、IL-10的變化，RealTimePCR檢測靜息狀態(tài)下mRNA水平IFN-γ、 IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21在RA患者PBMC中的表達，并結(jié)合RA患者PD-1Δex3的表達做相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:①IFN-γ、 IL-4、

10、IL-10在T細胞體外活化各時相的表達呈上升趨勢;②RA患者IFN-γmRNA水平的表達明顯高于HC(P=0.0421)，與OA無明顯差異(P=0.1637)，IFN-γ與PD-1Δex3的表達具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4633，P=0.0026);③RA患者IL-4mRNA水平的表達明顯高于HC(P=0.0359)和OA(P=0.0499)，與PD-1Δex3的表達具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4109，P=0.0069);④RA患者

11、IL-10mRNA水平的表達與HC(P=0.4104)和OA(P=0.2267)無明顯差異，IL-10與PD-1Δex3的表達具有正相關(guān)性(r=0.4374，P=0.0048);⑤RA患者IL-17A mRNA水平的表達明顯高于HC(P=0.0420)和OA(P=0.0428)，IL-17A與PD-1Δex3的表達具有明顯的正相關(guān)性(r=0.4065，P=0.0092);⑥RA患者IL-21的表達明顯高于HC組(P=0.0425)，但與

12、OA組無明顯差異(P=0.0702)，與PD-1Δex3的表達無明顯相關(guān)性（r=0.1761，P=0.2471）。
　　 結(jié)論:T細胞亞群的異?；罨嚓P(guān)炎性細胞因子的上調(diào)可能與sPD-1的產(chǎn)生有關(guān)，為進一步研究T細胞亞群在RA免疫病理進程中的作用，以及對sPD-1的調(diào)控提供新的思路。
　　 第二節(jié)PDCDI基因多態(tài)性與sPD-1的表達。
　　 目的:尋找RA患者內(nèi)含子2-外顯子3-內(nèi)含子3序列的SNP位點，研究

13、選擇性剪接異構(gòu)體PD-1Δex3的產(chǎn)生與RA患者遺傳背景的關(guān)系。
　　 方法:通過PCR-直接測序的方法掃描PDCDI基因內(nèi)含子2-外顯子3-內(nèi)含子2序列，篩查該序列內(nèi)中國人群特異性SNP位點;對中國人群RA患者和健康對照候選SNP位點進行基因分型，分析SNP位點與RA的相關(guān)性;將SNP的基因分型結(jié)果與RA患者sPD-1的表達進行綜合分析。
　　 結(jié)果:①發(fā)現(xiàn)目標序列上存在3個SNP位點，其中SNP2和SNP3為新發(fā)現(xiàn)位

14、點，生物信息學軟件預測這3個SNP位點分別位于剪接因子SRp40、SC35和SF2/ASF的結(jié)合靶點內(nèi);②SNP1(rs34819629)G等位基因在RA病人組中的分布頻率明顯大于正常對照組(P=0.021)，基因型頻率分布在RA病例和對照組之間的分布有顯著性差異(P=0.037)，最佳遺傳模式為加性;③SNP1 G/G和A/G基因型RA患者sPD-1的表達明顯高于A/A基因型RA患者(P=0.0237，P=0.0488)。