1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)是歐美國家常見的腫瘤,居男性腫瘤死亡原因第二位,僅次于肺癌。我國前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國家,但隨著生活水平的提高及人口老齡化發(fā)展,其發(fā)病率正迅速上升,成為危害中老年男性健康的主要疾病。前列腺癌的發(fā)病及惡化轉移機制復雜,不僅與種族,飲食、生活習慣等關系密切,并且癌基因和抑癌基因及其相應的信號通路的異常調控直接參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。
　　 Vanaja等[3]根據(jù)

2、芯片結果分析PDLIM4(PDZ and LIM domain4)基因在前列腺癌中表達發(fā)生沉默。PDLIM4基因,又稱RJL(reversion-induced LIM gene),是定位于5號染色體長臂上31.1的抑癌基因,編碼含PDZ和LIM區(qū)域的蛋白,生物學功能目前尚未清楚[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)PDLIM4基因在正常細胞中普遍表達,而在腫瘤細胞中常發(fā)生缺失,通過穩(wěn)定轉染恢復表達可以抑制腫瘤細胞增殖和集落形成,并促進細胞發(fā)生凋亡[6]

3、。初步認為具有抑癌基因的功能。目前研究表明,PDLIM4低表達與雜合子缺失、啟動子區(qū)域CpG島的異常高甲基化密切相關,且PDLIM4甲基化失活常和前列腺癌預后較差相關[6,7]。
　　 DNA甲基化是表觀遺傳學主要研究內容之一。DNA甲基化主要指基因啟動子區(qū)域CpG島中胞嘧啶C發(fā)生甲基化,由于DNA甲基化是一個可逆的過程,通過藥物逆轉啟動子區(qū)域的甲基化可使沉默的基因恢復表達[8-11]。DNA甲基化可導致抑癌基因轉錄失活,進而影

4、響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-15]。人前列腺癌中PDLIM4基因啟動子核心區(qū)域中含有多個CpG島,已證實其CpG島高度甲基化與PDLIM4表達下調密切相關但其調控機制尚不明確。
　　 我們首先通過免疫組化檢測中國漢族人群中前列腺癌患者PDLIM4在前列腺增生組織及前列腺癌組織中的表達,已確定該基因的表達是否存在種族差異。同時檢測相關的甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)DNMT3A及DNMT3B在相應

5、組織中的表達水平。結果顯示在前列腺癌組織中PDLIM4的表達明顯低于正常癌旁組織及前列腺增生組織,與國外的研究報道一致,表明該基因的表達無顯著的種族差異。而DNMT3A及DNMT3B表達在增生組織及癌組織中無明顯差異。
　　 為了研究PDLIM4基因在前列腺癌中低表達的調控機制,我們通過Westernblotting確定前列腺癌激素依賴及非依賴細胞株中PDLIM4蛋白的表達水平。結果顯示,PDLIM4在正常人前列腺永生細胞株RW

6、PE1中表達,而在激素非依賴的前列腺癌細胞PC-3、激素依賴的LNCaP中表達沉默。經過甲基轉移酶抑制劑5-aza-dc處理后,LNCaP細胞中PDLIM4的表達明顯上調,而RWPE1和PC3表達未發(fā)生明顯改變,表明PDLIM4的表達不僅與其啟動子CpG島甲基化有關,可能還存在其它的調控機制。
　　 由于PDLIM4的表達調控發(fā)生在轉錄水平,我們以基因組DNA為模板,通過PCR擴增獲得PDLIM4基因啟動子序列片段,插入到pGL

7、3-Basic報告基因載體,分別得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因啟動子的兩個報告基因質粒pGL3-PDLIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。另外,pGL3-PDLIM4-1.2kb質粒運用外切酶Ⅲ將啟動子從5’端截短獲得系列不同短片段的啟動子序列,并構建其熒光素酶報告基因的重組質粒,得到5個含不同長度啟動子序列的報告基因載體:pGL3-PDLIM4—970bp,pGL3一PDLIM4-803bp,pGL3-P

8、DLIM4-653bp,pGL3-PDLIM4-645bp,pGL3-PDLIM4—627bp。利用PDLIM4啟動子及其不同截短體報告基因轉染不同組織來源細胞系及各前列腺細胞株,檢測其表達情況。結果表明,PDLIM4基因長片段的3kb和1.2kb啟動子熒光素酶質粒,在乳腺癌細胞株、宮頸癌細胞株、人口腔上皮腫瘤細胞株、前列腺癌細胞株中均有不同程度的表達活性,,其中在前列腺癌細胞株PC3、LNCaP中表達較低。而不同長度的PDLIM4啟動

9、子報告基因質粒轉染PC-3、LNCaP的結果顯示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表達活性最強,pGL3-PDLIM4-970bp表達活性最弱,說明在啟動子-1275bp至-970bp區(qū)域內可能存在一個正調控元件。
　　 前列腺癌細胞株轉染PDLIM4啟動子,經5-aza—dc處理后,與未處理的細胞比較啟動子活性變化。結果顯示,LNCaP經5-aza-dc處理后PDLIM4的啟動子活性明顯上調(p<0.05),而PC-3經5-

10、aza—dc處理后啟動子活性發(fā)生下調,RWPE1未發(fā)生明顯改變。經5-aza—dc處理后啟動子活性的變化與蛋白表達水平的變化相一致。說明了甲基化在激素依賴的LNCaP是主要的調控機制,而在激素非依賴的PC-3細胞中可能存在非甲基化調控機制。
　　 綜上所述,抑癌基因PDLIM4在中國漢族人群前列腺癌組織和激素依賴的前列腺癌細胞中沉默,其啟動子區(qū)域的甲基化對基因的沉默起著重要作用,去甲基化后可使PDLIM4在轉錄和蛋白翻譯水平上恢