1、特殊環(huán)境(包括深海、火山口、高熱、超低溫、高鹽、紅樹林、沙漠等)來源微生物一直以來受到生物、化學、生態(tài)學等領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。其中濱海鹽堿地具有高鹽、高pH值等特殊物理化學性質(zhì),生存于其中的真菌有可能形成獨特的代謝機制進而產(chǎn)生新穎的活性次級代謝產(chǎn)物,成為藥物先導化合物發(fā)現(xiàn)的一個潛在資源。為探索這一特殊環(huán)境來源的真菌及活性次級代謝產(chǎn)物,本論文對黃河三角洲轄地濱州沾化市臨海鹽堿地的真菌進行了分離并初步研究了其物種多樣性;對所得菌株進行了活性篩選

2、和化學篩選,對從中得到了5株活性菌株進行了次級代謝產(chǎn)物的研究;對所獲得新化合物進行了抗腫瘤、抗菌等活性篩選和評價,并對secalonic acid F的體內(nèi)抗腫瘤作用及其機制進行了初步探討。
　　1.濱海鹽堿地真菌物種多樣的初步調(diào)查以及抗菌、抗腫瘤活性研究:對隸屬黃河三角洲濱州沾化臨海重度鹽堿地進行了真菌分離,共獲得26株真菌;結(jié)合形態(tài)學、和分子生物學鑒定方法,確定這些微生物的種屬(隸屬6科,8屬),分別是叢梗孢科的青霉屬( Pe

3、nicillium)真菌5株、曲霉屬( Aspergillus)真菌15株,球腔菌科的枝孢霉屬(Cladosporium)真菌1株,赤殼科的鐮孢霉(Fusarium)屬真菌1株,肉座菌科的支頂孢屬(Acremonium)真菌1株、木霉屬(Trichoderma)真菌1株,毛霉菌科毛霉屬(Mucor)真菌1株以及雙足囊菌科的白地霉屬(Galactomyces)真菌1株。曲霉屬(Aspergillus)真菌占分離菌株總數(shù)的57.7％,其次為

4、青霉屬(Penicillium)真菌,占19.2%;多樣化程度較高。并用Mega5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　以抗菌(革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌,檸檬色葡萄球菌,白色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌:大腸桿菌,變形桿菌,傷寒桿菌,綠膿桿菌)、A549腫瘤細胞增殖抑制實驗為活性篩選模型,初步評價了所得菌株的抗菌和抗腫瘤活性。結(jié)果表明,所測試真菌對至少一種受試菌具有抑制作用(φ抑菌圈≥8 mm)的菌株占比例達46.5%;對A549腫瘤細胞

5、增殖抑制IC50值在50μg/mL內(nèi)的有8株菌株,占總數(shù)的30.7%。說明該地域的真菌具有一定的抗菌作用和抗腫瘤作用;結(jié)合高效液相(HPLC-DAD)指紋圖譜為化學篩選共得到5株具有一定研究價值的真菌。
　　2.對5株鹽堿地來源的真菌次級代謝產(chǎn)物進行了較為系統(tǒng)的研究:大量發(fā)酵后,應(yīng)用天然產(chǎn)物分離的方法(重結(jié)晶法、沉淀法以及薄層色譜、正反相硅膠色譜、LH20凝膠色譜、半制備高效液相色譜等)對5株真菌的次級代謝產(chǎn)物進行了分離,應(yīng)用現(xiàn)代

6、波譜技術(shù)(UV、IR、NMR、MS、X-ray等)鑒定了所得化合物的化學結(jié)構(gòu);從Aspergillus fumigates JH43中獲得了16個化合物(包括1個新化合物,結(jié)構(gòu)包括橋環(huán)類化合物、螺內(nèi)酰胺類生物堿、色氨酸和脯氨酸衍生的吲哚生物堿、二氧哌嗪類、甾醇類)。從Aspergillus iizukae KL33中分離得到11個化合物(2個新化合物,1個新天然產(chǎn)物),結(jié)構(gòu)包括二聯(lián)苯類、蒽醌類、苯酚類;從Penicillium jant

7、hinellum KL24中分離得到11化合物,結(jié)構(gòu)包括二氧哌嗪類、嘧啶生物堿類、丁烯酸內(nèi)酯類、二倍半萜類、甾醇類;從Aspergillus aculeatus WD5中得到8個化合物,結(jié)構(gòu)包括呋喃甲酸類、苯甲酸類、蒽醌類、二聚四氫酮類;從Aspergillus clavatonanicus WD8中得到10個化合物,結(jié)構(gòu)包括:甾醇類,苯甲酸類,苯酚類,蒽醌類,羧酸類,六元內(nèi)酯類,氨基酸和二氧哌嗪類。結(jié)果表明濱海鹽堿地來源真菌次級代謝產(chǎn)

8、物具有高度的結(jié)構(gòu)多樣性。
　　生物活性評價表明,化合物iizukae A具有一定的抗菌活性;iizukae A和iizukae B對HL-60,A-549和BEL-7402腫瘤細胞有弱的抑制作用。
　　3.初步探討了secalonic acid F(SAF)的體內(nèi)抗腫瘤活性及作用機制。菌株WD5 Aspergillus aculeatus中產(chǎn)量較大的SAF具有顯著的抗腫瘤活性,但其體內(nèi)抗腫瘤作用及其作用機制尚未見報道。本文發(fā)

9、現(xiàn)該化合物能明顯抑制HepG2的增殖, IC50為6.8μM,并呈現(xiàn)濃度、時間依賴性關(guān)系。以小鼠肝癌(H22)瘤株為模型進行體內(nèi)抗腫瘤活性評價結(jié)果顯示在 SAF在50 mg/kg劑量下,對荷 H22小鼠的抑瘤率高達94.74%,優(yōu)于陽性對照5-FU;給SAF處理組小鼠毛色光澤,活動靈活;且SAF在低濃度下(10 mg/kg)下可以使胸腺指數(shù)略有提高,提示低劑量SAF在器官水平有提高機體免疫調(diào)節(jié)作用。進一步抗腫瘤活性作用機理研究發(fā)現(xiàn)該化合

10、物能夠明顯誘導HepG2細胞凋亡,并初步證實細胞受刺激產(chǎn)生的大量的活性氧很可能作為信號分子參與或啟動了SAF誘導的HepG2細胞凋亡過程。
　　綜上所述,本論文首次對黃河三角洲鹽堿地真菌物種多樣性及其次級代謝產(chǎn)物進行了初步研究,構(gòu)建了真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹,初步評價了所分離真菌的抗菌、抗腫瘤活性,從5株鹽堿地真菌的次級代謝產(chǎn)物獲得化合物51個,其中新化合物3個;對其抗菌和抗腫瘤活性做了初步評價;首次對SAF抗肝腫瘤活性和機制進行了初步研