1、目的：采用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）模型，結(jié)合藥效學(xué)實驗、血液生化實驗、組織形態(tài)學(xué)實驗等明確甘草中的活性提取部位甘草總黃酮（licorice flavonoids，LF）對非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用；采用免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印跡等實驗方法，研究甘草總黃酮對非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用與AMPK信號分子之間的關(guān)系。
　　方法：采用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非

2、酒精性脂肪肝模型。雄性SD大鼠120只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為2組：正常對照組20只，給予普通維持飼料，其中蛋白質(zhì)熱卡占20％，碳水化合物熱卡占70%，脂肪熱卡占10%；高脂飲食組100只，給予高脂飼料喂養(yǎng)，其中蛋白質(zhì)熱卡占20%，碳水化合物熱卡占35%，脂肪熱卡占45%。正常對照組和高脂飲食組分別以各自飼料喂養(yǎng)13周。高脂飲食組在第13周末時，按體重排序。將體重排位在后30位的大鼠歸為高脂飼料不敏感大鼠進行剔除，將剩余70只

3、視為對高脂飼料敏感大鼠、重新進行隨機分組。按體重隨機分為6組：模型對照組、甘草黃酮實驗組（50、150、400mg·kg-1）、陽性藥物對照組（二甲雙胍300mg·kg-1、非諾貝特40mg·kg-1）。第14周開始藥物干預(yù)，藥物干預(yù)時間6周，干預(yù)同時，除正常對照組外，其余6組均繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料。造模期間及藥物干預(yù)期間，每天監(jiān)測各組實驗大鼠體重和攝食量情況。待藥物干預(yù)結(jié)束后，行烏拉坦（1.4g/kg，i.p）麻醉大鼠，經(jīng)股動脈取血處死，

4、離心所得血清測定血脂四項、肝功能和血清抗氧化等指標(biāo)。取血后的大鼠，迅速取出腎臟及睪丸周圍的脂肪組織并稱重，計算脂肪系數(shù)。取肝臟組織并稱重后，先切取肝大葉中的一小部分置于包埋盒中于4%多聚甲醛溶液中固定，用以后期做石蠟包埋及切片，用來做免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）實驗。剩余肝臟部分置于錫箔紙中于液氮中保存，后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱保存，用以免疫蛋白印跡（Western Blot）實驗。
　　結(jié)果：
　　1.

5、造模期間及藥物干預(yù)期間各組大鼠攝食量情況：高脂飲食建立NAFLD大鼠模型期間，正常組與高脂組的攝食量基本一致，兩組之間攝食量差異并不明顯，正常組與高脂組大鼠攝食量基本維持在28g/d；藥物干預(yù)期間，各組實驗大鼠在藥物干預(yù)初期，由于灌胃刺激，攝食量均普遍下降，在藥物干預(yù)第四周，攝食量升高，直至第六周，攝食量呈平穩(wěn)增長，各實驗組基本維持在25g/d。在實驗期間各組大鼠攝食量沒有明顯差異，表明造成各組大鼠體重差異的結(jié)果是由于飼料成分的不同。<

6、br>　　2.甘草總黃酮對各組實驗大鼠體重增長率的影響：與正常組比較，模型組體重增長率高于正常組（p<0.01）；與模型組比較，各藥物實驗組體重增長率低于模型組（p<0.05，p<0.01），表明甘草總黃酮可以抑制高脂飲食引起的大鼠體重的增加。
　　3.甘草總黃酮對各組實驗大鼠脂肪系數(shù)的影響：與正常組比較，模型組脂肪系數(shù)高于正常組（p<0.01）；與模型組比較，各藥物實驗組脂肪系數(shù)低于模型組（p<0.01），表明甘草總黃酮對大鼠肥

7、胖度有一定抑制作用。
　　4.甘草總黃酮對血液生化指標(biāo)的影響：
　?。?）甘油三酯（TG）：與正常組比較，模型組血清甘油三酯升高（p<0.01）。與模型組比較，各藥物實驗組血清甘油三酯降低（p<0.05，p<0.01）。
　?。?）總膽固醇（TC）：與正常組比較，模型組血清總膽固醇升高（p<0.05）。與模型組比較，各藥物實驗組血清總膽固醇降低（p<0.05，p<0.01）。
　?。?）低密度脂蛋白（LDL）：與

8、正常組比較，模型組血清低密度脂蛋白升高（p<0.05）。與模型組比較，各藥物實驗組血清低密度脂蛋白降低（p<0.05，p<0.01）。
　?。?）高密度脂蛋白（HDL）：與正常組比較，模型組血清高密度脂蛋白降低（p<0.01）。與模型組比較，各藥物實驗組血清高密度脂蛋白升高（p<0.05，p<0.01）。
　?。?）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）：與正常組比較，模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶值升高（p<0.01）；與模型組比較，除甘草黃酮50 mg

9、·kg-1劑量組外，其余藥物實驗組ALT值均降低（p<0.05，p<0.01）。
　?。?）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）：與正常組比較，模型組谷草轉(zhuǎn)氨酶值升高（p<0.01）；與模型組比較，各藥物實驗組谷草轉(zhuǎn)氨酶值均降低（p<0.05，p<0.01）。
　　（7）丙二醛（MDA）：與正常組比較，模型組血清MDA值升高（p<0.01）；與模型組比較，各藥物實驗組血清MDA值均降低（p<0.05，p<0.01）。
　　（8）超氧化

10、物歧化酶（SOD）：各實驗組大鼠血清SOD值無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。
　?。?）游離脂肪酸（FFA）：與正常組比較，模型組血清 FFA值升高（p<0.01）；與模型組比較，各藥物實驗組血清FFA值均降低（p<0.05，p<0.01）。
　　5.組織形態(tài)學(xué)結(jié)果
　?。?）HE染色結(jié)果
　　各組大鼠肝臟組織中，脂滴呈大小不等的規(guī)整的圓形空泡。與正常組比較，模型組大鼠肝組織內(nèi)可以看到多灶性、大小不等的規(guī)整的圓形空

11、泡即脂肪空泡在整個肝組織內(nèi)彌漫散在；與模型組比較，甘草黃酮低劑量組脂肪空泡較少呈多灶性、彌漫分布在肝組織胞漿區(qū)域；甘草黃酮中劑量和高劑量組脂肪空泡顯著減少，只有在極個別細胞內(nèi)可以看到散在的圓形空泡。陽性藥物二甲雙胍和非諾貝特組大鼠肝臟組織中，可看到散在的圓形空泡存在于肝細胞的胞漿中。結(jié)果提示，甘草總黃酮對高脂飲食引起的輕度脂肪肝有一定干預(yù)作用。
　　（2）油紅O染色結(jié)果
　　各組大鼠肝臟組織中，脂滴會被染成紅色。與正常組比較

12、，模型組脂滴多且廣泛分布在肝臟組織胞漿中；與模型組比較，甘草黃酮低劑量組脂滴減少并不明顯，但甘草黃酮中劑量和高劑量組脂滴明顯減少；二甲雙胍和非諾貝特組脂滴較模型組也顯著減少。結(jié)果提示，甘草總黃酮對高脂飲食引起的輕度脂肪肝有一定干預(yù)作用。
　　6.免疫組織化學(xué)結(jié)果：
　?。?）與正常組相比，模型組大鼠肝臟胞漿中AMPK分子免疫反應(yīng)陽性細胞表達弱，平均光密度值降低（p<0.05）；與模型組相比，各藥物實驗組在肝臟胞漿中AMPK分

13、子免疫反應(yīng)陽性細胞表達明顯增強，平均光密度值升高（p<0.05,p<0.01）。
　　（2）與正常組相比，模型組大鼠肝臟胞漿區(qū)域p-AMPKα分子免疫反應(yīng)陽性細胞表達弱，平均光密度值降低（p<0.05）；與模型組相比，各藥物實驗組在大鼠肝臟胞漿中p-AMPKα分子免疫反應(yīng)陽性細胞表達增強，平均光密度值均顯著升高(p<0.01)。
　　7.Western blot結(jié)果
　?。?）與正常組比較，模型組大鼠肝臟中AMPKα蛋

14、白表達量降低（p<0.05）。與模型組比較，甘草黃酮各劑量組和陽性藥物組大鼠肝臟中AMPKα蛋白表達明顯升高（p<0.01）
　?。?）與正常組比較，模型組大鼠肝臟中p-AMPKα蛋白表達較正常組降低（p<0.05）。與模型組比較，甘草黃酮低劑量組和非諾貝特組大鼠肝臟中p-AMPKα蛋白的表達升高不明顯，而甘草黃酮中劑量與高劑量組 p-AMPKα蛋白的表達明顯升高（p<0.05，p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.甘