1、目的
　　在我國(guó)肺癌總體發(fā)病率已位居惡性腫瘤第一位，肺癌惡性程度高，治療效果不是很理想，5年生存率不高。順鉑是化療常用藥物之一，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂。SIRT1屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰酶，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，對(duì)于肺癌細(xì)胞的化療敏感性可能也有重要影響。EX527是新型的一種特異性的高效的SIRT1抑制劑，本實(shí)驗(yàn)試圖在體外實(shí)驗(yàn)中觀察EX527對(duì)人肺癌A549細(xì)胞順鉑敏感性的作用，

2、并觀察在這過(guò)程中SIRT1及其靶分子蛋白的變化。
　　方法
　　1.采用MTT法測(cè)定EX527與順鉑聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞活力的作用，
　　2.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測(cè)定EX527與順鉑聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.采用3H-TDR摻入法測(cè)定EX527與順鉑聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞DNA合成能力的影響。
　　4.分別采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和WesternBlotting來(lái)測(cè)定SIRT1在mRNA和蛋白

3、水平表達(dá)的變化，
　　5.采用SIRT1活性測(cè)定試劑盒測(cè)定EX527與順鉑聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞SIRT1活性的變化。
　　6.分別采用DAPI和AnnexinV-FITC染色法，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)EX527與順鉑聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的作用，
　　7.采用DCFH-DA染色法測(cè)定A549細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化，采用WesternBlotting來(lái)測(cè)定SIRT1靶分子乙酰化和表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)

4、果
　　1.順鉑和EX527單獨(dú)處理A549細(xì)胞都使細(xì)胞活力下降，并具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，EX527聯(lián)合順鉑處理A549細(xì)胞活力下降明顯低于順鉑處理組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EX527能增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的增殖和DNA合成抑制功能，EX527能夠增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的G1期阻滯，誘導(dǎo)生成更多的SubG1期細(xì)胞，細(xì)胞凋亡更多。
　　2.順鉑單獨(dú)處理、EX527單獨(dú)處理和聯(lián)合處理組之間SIRT1mRNA水平?jīng)]有顯著的變化，順鉑處理可

5、以顯著升高SIRT1蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平，而EX527處理則沒(méi)有明顯的作用，而且EX527不能抑制順鉑誘導(dǎo)的SIRT1蛋白表達(dá)，EX527能夠降低A549細(xì)胞內(nèi)源SIRT1的活性，而且顯著抑制由于蛋白水平升高導(dǎo)致的SIRT1的去乙?；富钚缘纳摺?br>　　3.順鉑可以升高A549細(xì)胞內(nèi)的活性氧成分，而且EX527可以進(jìn)一步提升細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。EX527可以升高乙?；痯53的水平和Foxo3a及p21的表達(dá)水平。

6、　　結(jié)論
　　EX527能夠明顯增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，表現(xiàn)在細(xì)胞活力的降低、細(xì)胞增殖速度的減慢、DNA合成的抑制。EX527不是通過(guò)改變SIRT1的mRNA或蛋白表達(dá)水平來(lái)抑制其功能的，而是通過(guò)直接抑制SIRT1的去乙?；富钚浴X527增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性可能的機(jī)制有:1.G1期細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)，2.與誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。3.EX527可以提高p53的乙?；?，增強(qiáng)p53的促細(xì)胞周期