1、牛乳是由母奶牛乳腺分泌出的一種具有膠體特性，含有幼畜生長(zhǎng)發(fā)育所必需的全部營(yíng)養(yǎng)成分的均勻生物學(xué)液體，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中含有許多促進(jìn)人類生長(zhǎng)發(fā)育及維持健康水平所必需的營(yíng)養(yǎng)成分。乳蛋白是乳營(yíng)養(yǎng)中最重要部分之一，乳蛋白含量已經(jīng)成為現(xiàn)在許多牛乳收購(gòu)計(jì)價(jià)系統(tǒng)的基礎(chǔ)物質(zhì)之一。由于乳及乳制品中蛋白含量較高且相對(duì)固定。因此，向乳中添加其它蛋白如動(dòng)物蛋白、植物蛋白來代替乳蛋白，增加乳中蛋白含量，己經(jīng)成為現(xiàn)在中國(guó)牛乳摻假的重要手段。 摻假乳不但

2、降低了乳產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致食物的安全問題，直接影響了奶農(nóng)、生產(chǎn)廠家和消費(fèi)者的利益?，F(xiàn)有的各種摻假檢測(cè)方法都存在一定的局限性，很多只適合于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用，需要復(fù)雜的樣品處理過程和昂貴的藥品、設(shè)備，還不能應(yīng)用于實(shí)踐當(dāng)中：有些只能對(duì)特定摻假物進(jìn)行檢測(cè)，其它一些摻假物可能會(huì)對(duì)此檢測(cè)方法有影響；有些需要時(shí)間過長(zhǎng)，不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。為此，本文結(jié)合牛乳驗(yàn)收過程中存在的實(shí)際問題，建立牛乳摻假的檢測(cè)方法。 本試驗(yàn)通過近一年的研究，分別開發(fā)

3、了比色法、離子交換色譜．積分脈沖安培法(anionic exchange chromatograph-integral pulse ampere determination,HPEAC-IPAD，)和2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitro fluorobenzene,DNFB，)柱前衍生高效液相色譜法用于檢測(cè)牛乳中摻加的水解膠原蛋白。 1．比色法檢測(cè)牛乳中摻加的膠原水解蛋白在膠原的羥脯氨酸(hydroxyproline，Hy

4、p)測(cè)定中，傳統(tǒng)的酸法水解是在110℃下使用6mol/L的HCl消解24h，其操作步驟繁瑣且所花時(shí)間較長(zhǎng)。通過旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)對(duì)酸水解條件的優(yōu)化，簡(jiǎn)化Hyp測(cè)定的操作步驟，縮短酸水解時(shí)間。HCl濃度，水解時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)Hyp的測(cè)定具有顯著影響。酸法水解測(cè)定Hyp的優(yōu)化條件為：HCl濃度11.6mol/L，水解溫度為110℃，水解時(shí)間6h。使用優(yōu)化后的條件測(cè)定Hyp縮短了測(cè)定時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作，而且靈敏度和重復(fù)性較好，可用于快速測(cè)定膠原水解蛋

5、白中的Hyp含量。 膠原水解蛋白中含有高比例的Hyp，采用分光光度計(jì)比色法首先測(cè)定Hyp的含量，由測(cè)得的Hyp量乘以7.93即可得出乳中摻加的動(dòng)物膠原水解蛋白的量。 該方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均較好。此方法所用儀器操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，且操作方法步驟簡(jiǎn)單。采用優(yōu)化后的水解條件來水解動(dòng)物膠原水解蛋白，可大大縮短水解時(shí)間，可以快速的檢測(cè)牛乳中摻加的動(dòng)物膠原水解蛋白(<7h)。該方法的檢出限為9.00gg/mL。摻加1％的膠原水解蛋白就

6、可以檢測(cè)得到。此方法是目前最常采用的方法之一，但是它在檢測(cè)精度方面與HPLC法相比有很大的不足。該法適合于在企業(yè)實(shí)驗(yàn)室使用。 2．離子交換色譜-積分脈沖安培法檢測(cè)牛乳中摻加的膠原水解蛋白本研究采用陰離子交換色譜-積分脈沖安培法檢測(cè)牛乳中摻加的動(dòng)物膠原水解蛋白。由于膠原水解蛋白中含有高比例的羥脯氨酸，由測(cè)得的羥脯氨酸含量乘以7.65得到牛乳中摻加的膠原水解蛋白量。該法無需衍生處理，可直接對(duì)羥脯氨酸進(jìn)行測(cè)定。 以AminoP

7、ac PAl0為色譜柱，流動(dòng)相A：超純水(>18.2Q)，流動(dòng)相B：0.25mol/L的NaoH，流動(dòng)相C：1.0mol/L的NaAC。采用離子交換色譜-積分脈沖安培法測(cè)定牛乳中摻加的膠原水解蛋白，當(dāng)Hyp在20～200nmol/L時(shí)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果表明該法具有較好的穩(wěn)定性(RSD小于3％)和較高的回收率(89.16％～100.48％)。此法的檢出限為1.0μg/mL。檢測(cè)精度高。分析可在42min內(nèi)完成。 3．2，4-

8、二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法檢測(cè)牛乳中摻加的膠原水解蛋白本試驗(yàn)采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)牛乳中摻加的膠原水解蛋白。由于膠原水解蛋白中含有高比例的Hyp，由測(cè)得的羥脯氨酸的含量乘以7.73可以得到牛乳中摻加的膠原水解蛋白的量。 本試驗(yàn)以symmetry-C18(150mm x3.9mm，i.d.5rma)為色譜柱，2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，梯度洗脫。流動(dòng)相A：0.05mol/L乙酸鈉緩沖溶