1、目的:研究選擇性環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑celecoxib對人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP細(xì)胞是否有增殖抑制作用及可能機制,探討celecoxib逆轉(zhuǎn)人卵巢癌耐藥株SKOV-3/DDP細(xì)胞耐藥性作用及可能機制。
　　 方法:1.用不同濃度順鉑作用于人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞及人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP細(xì)胞24h后,MTT比色法測定順鉑(DDP)對各組細(xì)胞的抑制率,計算親本細(xì)胞株及耐藥細(xì)胞株的半數(shù)抑

2、制濃度(IC50),判定SKOV-3/DDP細(xì)胞的耐DDP情況。2.用不同濃度celecoxib作用于人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP細(xì)胞,各濃度分別作用不同時間(24h、48h、72h)后,四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法測定不同藥物濃度組,作用不同時間后對SKOV-3/DDP細(xì)胞的抑制率,同時測定celecoxib應(yīng)用24小時非細(xì)胞毒性劑量:取約10％抑制濃

3、度(inhibiting concentration,IC10)作為藥物逆轉(zhuǎn)作用濃度。3.在聯(lián)合celecoxib非細(xì)胞毒性濃度作用下測定順鉑對SKOV-3/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),以此判斷celecoxib能否增加耐藥細(xì)胞對DDP的敏感性,逆轉(zhuǎn)耐藥。4.流式細(xì)胞儀分別測定單用DDP、單用celecoxib以及聯(lián)合后對SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡的影響。5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)測定人卵巢癌細(xì)

4、胞株SKOV-3細(xì)胞及人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP細(xì)胞中GST-π含量。6.流式細(xì)胞術(shù)分別定量檢測單用celecoxib干預(yù)不同時間、單用DDP組及DDP聯(lián)合celecoxib組SKOV-3/DDP細(xì)胞中Survivin、GST-π;蛋白表達(dá)的變化;7.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR,RT-PCR)法半定量檢測上述各組入卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV-3/DDP細(xì)胞中Survivin、GST-π

5、mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:1.DDP對SKOV-3細(xì)胞的IC50為10.119μM,對SKOV-3/DDP的IC50為27.815μM,耐藥倍數(shù)約為2.75倍。2.單獨應(yīng)用celecoxib作用SKOV-3/DDP細(xì)胞后,隨著藥物濃度增高,抑制率相應(yīng)增高。在celecoxib作用24h后各濃度組抑制率分別為0.564％、4.992％、9.089％、24.074％、44.104％、59.323％,與對照組比較,2.5μM無

6、明顯抑制,余各組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同一濃度隨著作用時間的延長,抑制率增大,逆轉(zhuǎn)濃度(10μM)分別作用24h、48h、72h后抑制率分別為9.089％、25.448％、30.635％,與對照組比較同樣具有顯著性差異(P＜0.01)。Celecoxib對SKOV-3/DDP細(xì)胞作用24h后IC10為8.247μM。3經(jīng)聯(lián)合非細(xì)胞毒性劑量celecoxib作用于SKOV-3/DDP細(xì)胞24h后,耐藥細(xì)胞對DDP的IC50從27

7、.815μM降至15.437μM,耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為1.8倍,celecoxib可以部分逆轉(zhuǎn)SKOV-3/DDP細(xì)胞的耐藥。4.單藥或者聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)SKOV-3/DDP細(xì)胞后凋亡率分別為:對照組5.105％,celecoxib組7.67％,DDP組16.99％,DDP聯(lián)合celecoxib組達(dá)到32.75％。用藥組與對照組比較差異(P＜0.01)顯著,聯(lián)合組與單用DDP組相比凋亡率差異顯著(P＜0.01),celecoxib可促進(jìn)DDP抗

8、腫瘤誘導(dǎo)凋亡作用。5.耐藥細(xì)胞與原代細(xì)胞相比,耐藥相關(guān)蛋白GST-π蛋白表達(dá)差異顯著,耐藥細(xì)胞的FI值約為親本細(xì)胞的1.034倍(P＜0.05)。6.經(jīng)celecoxib作用SKOV-3/DDP細(xì)胞24h、48h、72h后,survivin及GST-π蛋白的FI值較對照組減少(P＜0.01),隨著作用時間延長,survivin蛋白的FI值持續(xù)減少,分別為:0.994,0.951,0.945,48小時后趨勢減緩,其中用藥48小時與用藥72

9、小時相比,FI值無統(tǒng)計學(xué)意義。但是GST-π蛋白的FI值分別為:0.973,0.941,0.963,在作用72h后較作用48h反而升高;但實驗組與對照組比較,統(tǒng)計學(xué)意義明顯。7.單用DDP組和DDP聯(lián)合celecoxib組survivin蛋白較對照組均減少,分別為0.984,0.939,DDP聯(lián)合celecoxib后survivin蛋白表達(dá)量較單用DDP明顯減小,兩組相比較差異顯著(P＜0.01)。但是GST-π蛋白的FI值在應(yīng)用順鉑后

10、增高明顯,為1.056,與對照相比差異顯著(P＜0.01),應(yīng)用celecoxib后較單藥DDP下降明顯,為0.962,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。8.隨著celecoxib作用時間延長,survivin mRNA表達(dá)量也持續(xù)下降,survivin/GAPDH分別為0.711,0.701,0.518,0.475,與對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。GST-π/GAPDH與對照組相比,隨著作用時間延長,比值持續(xù)下降。分別為0

11、.877,0.624,0.463,0.545,與對照比較有明顯差異(P＜0.05)。9.單用DDP組、聯(lián)合celecoxib DDP組Survivin/GAPDH值較對照組均減少(P＜0.01),為0.496、0.34,且聯(lián)合用藥組較單藥組下降明顯。GST-π/GAPDH值在應(yīng)用順鉑后反應(yīng)性增高至0.987(P＜0.01)。應(yīng)用celecoxib后該比值可下降為0.925,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.

12、celecoxib單獨應(yīng)用在一定濃度范圍內(nèi)能有效抑制人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV-3/DDP細(xì)胞增殖,并呈濃度及時間依賴性;2.celecoxib聯(lián)合順鉑對SKOV-3/DDP細(xì)胞增殖抑制具有協(xié)同增效作用,celecoxib可增強順鉑的抗SKOV-3/DDP作用,促進(jìn)凋亡,逆轉(zhuǎn)耐藥。3.celecoxib逆轉(zhuǎn)耐藥的機制可能與下調(diào)survivin mRNA及蛋白表達(dá),下調(diào)GST-π mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。4.本實驗證實了celecoxib可