1、肥胖牛易發(fā)生胰島素抵抗，使得胰島素的敏感性下降，影響胰島素對體內(nèi)糖、脂肪的代謝的調(diào)節(jié)。脂肪代謝紊亂疾病和脂肪細胞分泌的各種因子有很大的關(guān)聯(lián)，而脂肪細胞的體外培養(yǎng)是研究脂肪細胞因子的一種理想的體外模型. 抵抗素被認為是聯(lián)系胰島素抵抗和肥胖的一個紐帶，研究認為抵抗素可以引起肝臟的胰島素抵抗，并且在奶牛泌乳期間，脂肪組織抵抗素表達升高。本實驗利用體外培養(yǎng)犢牛前脂肪細胞的原代及傳代培養(yǎng)技術(shù)和半定量RT-PCR方法研究脂肪細胞因子抵抗素在

2、脂肪細胞分化過程中的表達情況，及不同濃度胰島素、葡萄糖、非酯化脂肪酸對抵抗素mRNA豐度的影響。為了解奶牛胰島素抵抗、肥胖和抵抗素之間的關(guān)系奠定理論和實驗基礎(chǔ). 首先，對原代培養(yǎng)的脂肪細胞進行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，繪制細胞生長曲線，脂肪細胞油紅O含量變化曲線并根據(jù)油紅染色情況判斷脂肪細胞的分化程度，用RT-PCR的方法檢測細胞分化標(biāo)志物脂蛋白酯酶(LPL)、3-磷酸甘油酯脫氫酶、(GPDH)瘦素(LP)。用胎盤藍染色計算細

3、胞凍存后的存活率。 然后從犢牛的網(wǎng)膜組織提取總RNA，通過一對引物，成功的克隆了奶牛的抵抗素151bpcDNA序列，經(jīng)測序分析，同源性達到98﹪。在此基礎(chǔ)上，在原代培養(yǎng)脂肪細胞的4d，6d，8d，10d，12d，14d，16d分別提取細胞總RNA，以β-actin作為內(nèi)參照，定量分析脂肪細胞分化過程中抵抗素mRNA豐度變化.結(jié)果表明，脂肪細胞分化過程中，抵抗素mRNA是先降低后升高，在4d-12d抵抗素mRNA呈下降趨勢，12d

4、達到最低值，之后又開始回升。據(jù)此證明，抵抗素mRNA在前脂肪細胞和成熟脂肪細胞都有表達，在細胞分化過程減低，而在成熟脂肪細胞有隨著脂肪形成的增加而增加的趨勢，這一結(jié)果與人及鼠的研究結(jié)果有差異。但是我們恰恰觀察了人和鼠類實驗所沒有觀察到的10d、12d、14d天的表達情況，而抵抗素mRNA表達發(fā)生變化恰在這一時間。最后利用傳一代培養(yǎng)的脂肪細胞研究不同濃度的胰島素對抵抗素mRNA豐度的影響，利用原代培養(yǎng)的脂肪細胞研究不同濃度的葡萄糖、非酯化