1、由于工業(yè)化和城市化的不斷深入以及環(huán)境污染的加重等原因,近年來全球范圍內(nèi)變態(tài)反應性疾病的發(fā)病率和嚴重程度迅速增加。據(jù)統(tǒng)計,目前全球有4億過敏性鼻炎患者、3億哮喘患者,其中50％居住在發(fā)展中國家并且未得到有效的治療[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將變態(tài)反應性疾病列為全球重點防治的疾病。盡管世界各國投入了大量的人力及財力進行深入研究,變態(tài)反應性疾病的治療仍非常困難[2]。
　　目前變態(tài)反應性疾病的確切發(fā)病機制尚不清楚,但肥大細胞(mas

2、tcell,MC)是變態(tài)反應中的主要效應細胞,關于變態(tài)反應發(fā)病的效應機制較為明確:變應原特異性IgE與變應原結合后交聯(lián)MC表面的IgEFc受體(FcεRI),引起MC脫顆粒、組胺釋放等事件,進而導致變態(tài)反應癥狀的出現(xiàn)。因此,靶向抑制MC的功能或清除MC是治療變態(tài)反應性疾病的有效策略。近年來有多種MC相關抑制性免疫調節(jié)分子及其機制得到明確,為設計新的靶向抑制策略提供了可能。CD72是新近發(fā)現(xiàn)表達于MC的具有抑制功能的分子,其配體為CD10

3、0。在人MC,CD72通過與可溶型CD100(sCD100)結合而啟動對Scf/kit介導信號的負調控,從而抑制MC增殖、趨化和細胞因子的產(chǎn)生。
　　本研究提出構建HuCD100-Fcε融合蛋白靶向MC治療變態(tài)反應性疾病的新策略。HuCD100-Fcε融合蛋白的Fcε段以高親和力結合并封閉MC表面IgE受體FcεRI,HuCD100識別MC表面受體CD72,通過與CD72結合而抑制Scf/kit通路的激活,從而影響MC的存活、增殖

4、、趨化和細胞因子的產(chǎn)生。本研究擬將人CD100cDNA編碼胞膜外區(qū)的基因與人IgE的CH2-CH4基因連接,真核細胞表達HuCD100-Fcε融合蛋白,利用表達FcεRI和CD72的人肥大細胞系LAD2分析HuCD100-Fcε的結合活性以及對LAD2的作用。
　　研究目的:
　　1.獲取具有良好生物學活性的HuCD100-Fcε融合蛋白。
　　2.初步明確HuCD100-Fcε融合蛋白對人肥大細胞系LAD2的影響。研

5、究內(nèi)容與方法:
　　1.HuCD100-Fcε表達載體的構建:PCR擴增人Fcε基因,插入含有人CD100基因的質粒HuCD100/pcDNA3.1,構建真核表達載體pcDNA3.1-HuCD100-Fcε。
　　2.HuCD100-Fcε融合蛋白的瞬時表達及鑒定:瞬時轉染CHO細胞,ELISA、Westernblot檢測融合蛋白的表達。
　　3.HuCD100-Fcε融合蛋白的穩(wěn)定表達及鑒定:篩選穩(wěn)定轉染CHO細胞系

6、,有限稀釋法獲得高表達融合蛋白的細胞株。
　　4.HuCD100-Fcε融合蛋白對人肥大細胞系LAD2的作用:體外細胞系實驗分析HuCD100-Fcε融合蛋白對肥大細胞系LAD2增殖、脫顆粒的影響。
　　研究結果:
　　1.獲得了T-vector-Fcε質粒和pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質粒,將pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質粒轉染CHO細胞后,ELISA和Western blot鑒定融合

7、蛋白HuCD100-Fcε成功表達。
　　2.pcDNA3.1-HuCD100-Fcε重組質粒穩(wěn)定轉染CHO細胞,獲得了穩(wěn)定表達HuCD100-Fcε融合蛋白的細胞系。
　　3.體外實驗證明融合蛋白HuCD100-Fcε能抑制人肥大細胞系LAD2的脫顆粒和增殖。
　　結論:
　　本研究首次提出構建HuCD100-Fcε融合蛋白治療變態(tài)反應性疾病的新策略,獲得了具有良好結合活性及生物學功能的HuCD100-Fcε融