1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作為種子細(xì)胞在骨組織工程中的研究已日趨深入,那么如何獲得大量功能狀態(tài)良好的細(xì)胞以及如何促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化是目前研究的熱點(diǎn)。影響B(tài)MSCs體外生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞增殖能力和成骨分化能力的因素有很多,如血清、培養(yǎng)基、細(xì)胞接種密度、PH值、O2濃度、溫度、濕度、剪切應(yīng)力、生長(zhǎng)因子等。L-型鈣通道屬于電壓門(mén)控鈣離子通道,是Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的最主要通道之一

2、,參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞功能活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞上存在L-型鈣通道,并對(duì)成骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性起重要作用。而成骨細(xì)胞主要來(lái)源于BMSCs,兩者的生物學(xué)特性非常相似,所以推測(cè)L-型鈣通道可能也參與了BMSCs的增殖和成骨分化過(guò)程。因此本研究通過(guò)阻斷BMSCs上L-型鈣通道,觀察該通道對(duì)BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)以及成骨分化能力的影響,初步探討L-型鈣通道在BMSCs生長(zhǎng)中的作用和進(jìn)一步從分子水平探討B(tài)MSCs成骨分化的機(jī)制。
　　整個(gè)研究分

3、為以下幾個(gè)部分:
　　(1)全骨髓貼壁篩選法體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)并傳代,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),通過(guò)誘導(dǎo)rBMSCs成骨、成脂分化進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果:取第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)。成脂誘導(dǎo)第7d,油紅染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)明顯的紅色脂滴,說(shuō)明此細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞,成骨誘導(dǎo)第21 d?時(shí),茜素紅染色可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中明顯的礦化結(jié)節(jié),說(shuō)明此細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。結(jié)果表明,經(jīng)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)及

4、傳代而來(lái)的細(xì)胞,是具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　(2) RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SD大鼠BMSCs?鈣通道的基因表達(dá)。RT-PCR結(jié)?果顯示:L‐型鈣通道亞基alC、CCHL2a mRNA以及T‐型鈣通道亞基alG、CACNA1 mRNA均呈高表達(dá)。結(jié)果證實(shí),SD大鼠BMSCs上存在L‐型鈣離子通道,為下一步研究L‐型鈣離子通道在rBMSCs增殖和成骨分化過(guò)程中的影響提供前體條件。并且,檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了SD大鼠BMSCs上還

5、存在T‐型鈣離子通道。
　　(3)取第三代rBMSCs,實(shí)驗(yàn)組加入L‐型鈣通道阻斷劑硝苯地平(nifedipine?,Nif)阻斷L‐型鈣通道,對(duì)照組不加Nif,常規(guī)培養(yǎng),MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖狀態(tài)、流式細(xì)胞儀觀察兩組細(xì)胞的周期變化。結(jié)果:阻斷L‐型鈣通道后第3天開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于對(duì)照組,且有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)Nif作用后,實(shí)驗(yàn)組的S期細(xì)胞比例為(19.22±4.91)％,較對(duì)照組細(xì)胞的同時(shí)期比例(45.3

6、3±8.64)％明顯減少,P＜0.01。結(jié)果表明,阻斷L-型鈣通道可以抑制BMSCs的DNA合成進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。
　　(4)取第三代rBMSCs,實(shí)驗(yàn)組加入Nif阻斷L‐型鈣通道,進(jìn)行rBMSCs成骨誘導(dǎo),對(duì)照組不加藥在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化,堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測(cè)兩組ALP活性、茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)含量。結(jié)果:rBMSCs?成骨誘導(dǎo)第1、3、5? d,兩組細(xì)胞內(nèi)? ALP活性檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組ALP活性較對(duì)照組明顯降低