1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是指病因尚不清楚的非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn'S disease，CD)，屬于自身免疫病。西方國(guó)家發(fā)病率一直很高，近年來(lái)國(guó)內(nèi)報(bào)告日漸增多，累計(jì)超過(guò)12萬(wàn)例次，已成為消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病和慢性腹瀉的主要病因。且多數(shù)患者反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，甚至需要手術(shù)治療，不僅給患者帶來(lái)巨大痛苦，且有癌變風(fēng)

2、險(xiǎn)，因此研究IBD的發(fā)病機(jī)制并進(jìn)而指導(dǎo)治療至關(guān)重要。但I(xiàn)BD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知腸道粘膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用。目前大多數(shù)研究者認(rèn)為，該病的發(fā)病多與環(huán)境、遺傳、感染和免疫學(xué)因素有關(guān)，是一種多基因參與的作用于免疫系統(tǒng)和靶器官的疾病，而免疫學(xué)因素在其發(fā)病過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。而在參與免疫炎癥過(guò)程的眾多因子和介質(zhì)里尋找到一個(gè)關(guān)鍵因子將是我們研究的重點(diǎn)。
　　 動(dòng)物模型是研究炎癥性腸病發(fā)

3、病機(jī)制的必要工具，目前可通過(guò)二種方法建立IBD模型。一種是通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因方法建立模型，另一種是通過(guò)人工誘導(dǎo)建立模型。前者雖具有自發(fā)性的特點(diǎn)，但是技術(shù)要求高，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件限制較大，費(fèi)用也要求較高。后者方法成熟，易于操作。本實(shí)驗(yàn)采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸免疫誘導(dǎo)BALB/C小鼠建立炎癥性腸病動(dòng)物模型，該法誘導(dǎo)的小鼠腸炎組織學(xué)改變的特點(diǎn)與人類IBD相似，模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，簡(jiǎn)單易行，易于

4、復(fù)制。
　　 CD4+輔助T細(xì)胞在IBD發(fā)病中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)，傳統(tǒng)的CD4+輔助性T細(xì)胞主要分為兩個(gè)亞群：Th1細(xì)胞亞群和Th2細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞亞群是近幾年才得到肯定的一類CD4+T細(xì)胞亞群，因其主要分泌IL-17而得名。既往關(guān)于IBD病因的研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是由于Th1/Th2的失衡造成IBD發(fā)病，但是尚有許多問(wèn)題無(wú)法解釋。現(xiàn)已證明，在多種自身免疫性疾病患者及這些疾病的動(dòng)物模型中IL-17表達(dá)均明顯升高，且其功能

5、狀態(tài)與多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此Th17細(xì)胞很可能在自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。由此，我們推斷Th17細(xì)胞很可能與IBD發(fā)病密切相關(guān)，對(duì)其進(jìn)行深入研究可能為我們尋找出IBD診斷的重要標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。若Th17細(xì)胞在IBD發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而可以為治療IBD提供新的途徑。本項(xiàng)工作對(duì)于IBD的基礎(chǔ)研究和臨床診療都有重要意義。
　　 在IBD的發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的變化對(duì)疾病的發(fā)生和發(fā)展起到重要的作用

6、。一些促炎細(xì)胞因子在IBD患者中存在分泌水平的變化，提示這些促炎細(xì)胞因子參與了IBD的病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察BALB/C小鼠IBD模型中的促炎細(xì)胞因子的變化和IL-17對(duì)其產(chǎn)生水平的影響，進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞在IBD發(fā)病中的作用機(jī)制。
　　 IBD患者存在免疫細(xì)胞凋亡異常，免疫細(xì)胞不正常凋亡可能是導(dǎo)致IBD發(fā)生的始動(dòng)原因。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察免疫后BALB/C小鼠脾單核細(xì)胞凋亡的變化和IL-17對(duì)其凋亡水平變化的影響，進(jìn)一步研

7、究Th17細(xì)胞在炎癥性腸病發(fā)病中的作用機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1、模型建立
　　 BALB/C小鼠，稱重編號(hào)后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和IBD模型組，正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)。模型組參考文獻(xiàn)用TNBS溶液灌腸建立小鼠IBD模型，制造模型前給予禁食24h，予5％水合氯醛0.08ml腹腔注射麻醉，按1:1混合TNBS和50%乙醇溶液共0.2ml給予小鼠灌腸，灌腸后正常喂養(yǎng)。處死小鼠后取病變較重部位結(jié)腸組織，還分別取外

8、周血，脾臟及腸系膜淋巴結(jié)。
　　 2、外周血單核細(xì)胞的制備小鼠經(jīng)眼球取血，將血置于抗凝管中，經(jīng)Ficoll-Hypaque分離液密度梯度離心，得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
　　 3、脾單核細(xì)胞的制備小鼠脾臟細(xì)胞懸液，經(jīng)Ficoll-Hypaque分離液密度梯度離心，得到脾單核細(xì)胞(SMC)。
　　 4、脾單核細(xì)胞的培養(yǎng)把灌腸后3天處死小鼠所需培養(yǎng)的SMC分為3組，每組含SMC1×106/ml，將三組細(xì)胞置于R

9、PMI-1640培養(yǎng)液中并分別加入1 u g/ml抗IL-17抗體，10ug/ml抗IL-17抗體，等量PBS。正常對(duì)照組小鼠取1×106/mlSMC亦置于RPMI-1640培養(yǎng)液中并加入等量PBS，四組細(xì)胞均置于37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后取出。
　　 5、ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織IL-17和IFN-γ
　　 組織勻漿離心取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，終止反應(yīng)后在450nm處讀取各孔吸光度值以各孔OD值為縱坐

10、標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值查找對(duì)應(yīng)的濃度。
　　 6、Western blot法檢測(cè)IL-17蛋白水平的變化用Western blot法檢測(cè)正常對(duì)照組和模型組3天處死小鼠血單核細(xì)胞，脾單核細(xì)胞，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞及結(jié)腸組織IL-17蛋白水平的變化。先將各組細(xì)胞及組織提取總蛋白，紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉2小時(shí)，加入一抗1:800兔抗鼠IL-17抗體

11、，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜，加入二抗1:1000羊抗兔IgG/HRP，室溫孵育2小時(shí)，沈膜3次，化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5分鐘，曝光、顯影。
　　 7、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定各組脾單核細(xì)胞IFN-γ，TNF-a，IL-6mRNA表達(dá)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品，以確定RNA的質(zhì)量并計(jì)算濃度。將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA用于PCR擴(kuò)增。b-actin為內(nèi)參照，上游引物為GAATAC

12、TCTATTGCCGATGGT，下游引物為CGATGGGTTTGCGTTTG，擴(kuò)增長(zhǎng)度為722bp。TNF-a上游引物為T(mén)TACGCCTTTGAAGTTAGCAG，下游引物為CGTCCAAATACATCGCAAC，擴(kuò)增長(zhǎng)度為498bp。IL-6上游為ACAACGGGTGGAACATTACC，下游引物為T(mén)GGGTTTGCGTTTGTGAG，擴(kuò)增長(zhǎng)度為422bp。IFN-γ上游引物為ACCCTCCTGGTTATTGAGCC，下游引物為T(mén)GG

13、TAATGTTCCACCCGTTG，擴(kuò)增長(zhǎng)度為288bp。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)紫外凝膠成像分析系統(tǒng)分析，根據(jù)目的基因條帶吸光度和內(nèi)參特異性條帶的吸光度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　 8、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾單核細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗IL-17抗體后，脾單核細(xì)胞凋亡的變化把脾單核細(xì)胞離心后5分鐘，用200ul Binding Buffer重懸細(xì)胞后再離心5分鐘，加入10ul AnneexinV-FITC和5u

14、lPI，再加入300ulBinding Buffer，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1、用TNBS灌腸可以成功誘導(dǎo)BALB/C小鼠結(jié)腸炎模型2、ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠灌腸后ELISA法檢測(cè)IL-17和IFN-γ在結(jié)腸組織中的表達(dá)。其中IL-17在灌腸后1天就明顯增高，灌腸后3天達(dá)到高峰后開(kāi)始下降，灌腸后14天和21天組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。IFN-γ在灌腸后1天無(wú)明顯增高，后緩慢升高，至灌腸后3天才有

15、顯著增高，灌腸后7天達(dá)到高峰后開(kāi)始下降，灌腸后14，21天與對(duì)照組比較仍有顯著差異。以上結(jié)果提示在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中IL-17的作用早于IFN-γ的作用。IL-17在灌腸后3天時(shí)表達(dá)最高，因此把灌腸后3天小鼠作為進(jìn)一步研究對(duì)象。
　　 3、Western blot檢測(cè)不同組織IL-17蛋白水平Western blot檢測(cè)正常對(duì)照組和模型3天組小鼠血單核細(xì)胞，脾單核細(xì)胞，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞及結(jié)腸組織IL-17蛋白水平的變化，其中

16、模型組脾單核細(xì)胞，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，結(jié)腸組織IL-17均較正常對(duì)照組明顯增高，尤其以結(jié)腸組織升高明顯。模型組血單核細(xì)胞IL-17與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　 4、RT-PCR檢測(cè) TNF-a、IFN-γ、IL-6mRNA表達(dá)模型組3天小鼠脾單核細(xì)胞分別加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗體、10 ug/ml抗IL-17抗體和正常對(duì)照組脾單核細(xì)胞加入PBS，四組細(xì)胞培養(yǎng)24h后用RT-PCR法檢測(cè)TNF-a、IFN-γ、IL

17、-6mRNA的表達(dá)。其中模型組中的PBS組TNF-a、IFN-γ、IL-6與正常對(duì)照的PBS組比較差異顯著。模型組中的1 ug組TNF-a、IL-6與模型組中的PBS組比較有所下降但無(wú)差異，而模型組中的1ug組IFN-γ與模型組中的PBS組比較亦無(wú)顯著性差異。模型組中的10ug組TNF-a、IL-6與模型組中的PBS組比較差異顯著，而模型組中的10ug組IFN-γ與模型組中的PBS組比較無(wú)顯著性差異。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾

18、單核細(xì)胞凋亡模型組脾單核細(xì)胞分別加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗體、10 ug/ml抗IL-17抗體和正常對(duì)照組脾單核細(xì)胞加入PBS，四組細(xì)胞培養(yǎng)24h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞與正常對(duì)照組和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞相比，凋亡比例明顯減少(p<0.05)，模型組中和1ug/ml抗IL-17抗體共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞與模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞相比，凋亡比例有所增加但不明顯。模型組

19、中和10ug/ml抗IL-17抗體共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞與模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細(xì)胞相比，凋亡比例明顯增多結(jié)論：
　　 1、用TNBS灌腸可以成功誘導(dǎo)BALB/C小鼠結(jié)腸炎模型2、Th17細(xì)胞具有組織器官的特異性及靶向性3、Th17細(xì)胞在IBD發(fā)病的早期階段起關(guān)鍵性作用，Th1細(xì)胞在維持炎癥的持續(xù)中發(fā)揮作用4、在IBD發(fā)病過(guò)程中Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞起到協(xié)同作用5、Th17細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)下游細(xì)胞因子產(chǎn)生促進(jìn)IBD的發(fā)生