1、目的：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,內分泌治療和分子靶向治療是乳腺癌的兩個重要治療手段。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)是雌激素受體拮抗劑,是乳腺癌內分泌治療的一線用藥,腫瘤壞死因子相關調亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是一種具有潛在林床應用價值的靶向生物制劑(Ⅱ期臨床試驗階段)。臨床上大部分患者在應用TAM一段時間后發(fā)生繼發(fā)耐藥,大部分乳腺癌

2、細胞對TRAIL原發(fā)性耐藥。研究TAM及TRAIL的耐藥機制,探索逆轉耐藥的新措施可為乳腺癌的內分泌及分子靶向治療提供理論依據。
　　 TAM主要通過競爭性與雌激素受體(estrogen receptor,ER)結合,從而拮抗雌激素,抑制ER陽性乳腺癌細胞增殖。研究發(fā)現乳腺癌細胞對內分泌治療藥物的敏感性與細胞存活通路的活性密切相關,HER-2等細胞膜生長因子受體過表達后可通過活化細胞內的存活通路導致細胞對TAM耐藥,抑制細胞內存

3、活通路的活性可增強乳腺癌細胞對TAM的敏感性。最近研究發(fā)現TAM可以通過ER非依賴的途徑誘導ER陽性及陰性的腫瘤細胞凋亡,但是TAM誘導乳腺癌細胞凋亡過程中細胞存活通路所發(fā)揮的作用尚不明確。本課題的第一部分將主要研究細胞存活通路在TAM誘導乳腺癌細胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。
　　 TRAIL通過與細胞膜上的死亡受體4(death receptor,DR)和死亡受體5(DR5)結合導致死亡受體通路起始因子Caspase-8的活化,

4、最終導致死亡底物PARP等的裂解,誘導細胞凋亡。既往研究發(fā)現乳腺癌細胞DR4/DR5的表達普遍較低或缺失,副作用較大的化療藥物,如表阿霉素、紫杉醇、順鉑等可通過上調死亡受體的表達增強腫瘤細胞對TRAIL的敏感性,但是副作用比較小的中藥增強乳腺癌細胞對TRAIL敏感性影響的報道尚少。本課題第二部分選擇傳統(tǒng)中藥蟾酥的有效成分蟾蜍靈(Bufalin),研究其對DR4/DR5的表達及乳腺癌細胞對TRAIL的敏感性的影響。
　　 泛素蛋白

5、酶體途徑是真核細胞內選擇性降解蛋白質的重要途徑。c-Cb1和Cb1-b是Cb1家族研究比較廣泛的E3泛素連接酶,它們可以通過特異性選擇底物蛋白啟動泛素化降解途徑,參與膜受體表達及細胞內信號通路活性的負性調節(jié)。本課題以乳腺癌細胞MCF-7細胞為模型,研究Cb1家族對細胞存活通路活性及TAM敏感性的調節(jié),以MCF-7和MDA-MB-231為模型研究Cb1家族對死亡受體表達的調節(jié)及對TRAIL敏感性的調控。
　　 材料與方法：

6、　　 1.采用MTT法檢測細胞活力,繪制細胞增殖曲線。
　　 2.采用流式細胞儀檢測細胞膜表面DR4/DR5的表達,PI單染法進行細胞周期分析、凋亡判定。
　　 3.采用Western blot檢測c-Cbl、Cbl-b、ERK、AKT、JNK、p38、DR4、DR5等蛋白的表達。
　　 4.采用RT-PCR方法檢測DR4/DR5的mRNA表達水平。
　　 5.采用LipofectaminTAM 200

7、0試劑進行瞬時轉染。
　　 6.統(tǒng)計學處理:每個實驗重復3次,數據以均值±標準差(-x±s)表示,兩組間差異采用t檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：
　　 1、TAM抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖誘導細胞發(fā)生凋亡
　　 TAM以時間和劑量依賴的方式抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖,24h、48h細胞增殖抑制率達50%的藥物濃度(IC50)分別為23.6±1.2μM和14.4±1.1μM。流式分析

8、顯示5μM的TAM作用于MCF-7細胞24h后僅有4.1%的細胞凋亡,25μM的TAM作用于MCF-7細胞16h和24h后,分別有10.2%和20.1%的細胞凋亡,提示TAM以時間及劑量依賴方式誘導MCF-7細胞凋亡。
　　 2、TAM對細胞存活信號活性的影響及細胞存活信號在細胞凋亡過程中發(fā)揮的作用。
　　 以誘導MCF-7發(fā)生明顯凋亡的TAM濃度(25μM)作用于細胞不同時間后檢測c-Src、Akt、ERK的表達及活性

9、的變化。Western blot分析結果顯示MCF-7細胞內有一定程度的基礎c-Src活性,在TAM作用16h和24h后c-Src的活性被抑制,表達水平被下調。TAM可誘導ERK的快速且持續(xù)的活化。TAM作用3h后AKT出現活化,24h后降至基礎水平以下。分別用10μM的PP2(c-Src特異性抑制劑),20μM的PD98059(ERK特異性抑制劑),10μM的LY294002(AKT特異性抑制劑)預處理1h后,給予25μM的TAM作用

10、24h,流式分析顯示,細胞的凋亡由20.1%分別上升至40.67%、45.88%和51.4%,提示c-Src、ERK和AKT在TAM誘導凋亡過程中發(fā)揮了保護性作用。
　　 3、乳腺癌細胞對靶向藥物TRAIL的敏感性及Bufalin對TRAIL敏感性的影響
　　 在MCF-7和MDA-MB-231細胞中,100ng/mL的TRAIL誘導＜7%的細胞凋亡。MTT結果顯示Bufalin以時間和劑量依賴的方式抑制MCF-7和MD

11、A-MB-231細胞增殖,MCF-7細胞24h和48h的IC50分別是317.9±1.5nM和46.5±1.4nM,MDA-MB-231細胞24h和48h的IC50分別是934.1±2.0nM和513.3±1.6nM,結果提示MCF-7細胞比MDA-MB-231細胞對Bufalin的敏感性高,因此我們選擇MCF-7細胞48h的IC50附近濃度(50nM)檢測Bufalin對TRAIL誘導凋亡的影響。流式分析結果顯示50nM的Bufali

12、n作用24h主要誘導細胞發(fā)生G2M期阻滯,僅誘導4～10%的細胞發(fā)生凋亡。Bufalin與TRAIL聯合作用24h可誘導30.1%的MCF-7細胞凋亡,41.5%的MDA-MB-231細胞凋亡,提示雖然不同的乳腺癌細胞系對Bufalin敏感性差異很大,但是低濃度的Bufalin均可增強它們對TRAIL誘導凋亡的敏感性。
　　 4、死亡受體表達的上調介導了Bufalin對TRAIL的增敏作用
　　 為明確Bufalin增強

13、TRAIL誘導細胞凋亡的機制,我們檢測了兩藥聯合作用后死亡受體凋亡通路活性的變化情況。Western blot分析結果顯示,兩藥聯合作用后可明顯活化死亡受體凋亡通路的啟動因子Caspase-8及死亡底物PARP。進一步研究發(fā)現,Bufalin作用后可在MCF-7和MDA-MB-231細胞中上調DR4和DR5蛋白及mRNA。采用siRNA抑制Bufalin對DR4和DR5的上調后,部分逆轉了Bufalin與TRAIL誘導的凋亡,結果提示D

14、R4和DR5的上調,部分介導了Bufalin增強TRAIL敏感性的過程。
　　 5、死亡受體表達的調控機制
　　 為研究Bufalin上調死亡受體DR4/DR5的機制,我們在MDA-MB-231細胞上檢測了Bufalin作用后ERK、JNK、p38活性的變化。Western blot分析結果顯示,Bufalin可誘導ERK、JNK和p38的活化。分別用ERK、JNK和p38特異性的抑制劑預處理2.5h后給予Bufalin

15、,結果DR4/DR5的上調被逆轉,同時Bufalin和TRAIL誘導的凋亡也被部分逆轉,結果提示ERK、JNK和p38的活化導致了DR4/DR5的上調。
　　 6、Cb1家族對TAM、Bufalin/TRAIL誘導凋亡的調控
　　 Western blot分析顯示TAM作用于MCF-7細胞后c-Cb1的表達上調。采用LipofectamineTM2000瞬時轉染野生型c-Cbl和c-Cbl的負性突變體70Z/Cbl后,流

16、式分析結果顯示“過表達”c-Cb1后,細胞對TAM的敏感性上調。70Z/Cb1抑制c-Cb1的泛素連接酶功能后細胞對TAM的敏感性下調。在Bufalin作用于MCF-7及MDA-MB-231細胞后,Western blot分析顯示c-Cb1的表達水平未見明顯變化,Cb1-b的表達水平逐漸下調。進一步研究發(fā)現“沉默”Cb1-b的表達后,細胞對Bufalin與TRAIL聯合誘導凋亡的敏感性明顯上調。以上結果提示Bufalin通過下調Cb1-

17、b的表達增強乳腺癌細胞對TRAIL的敏感性。
　　 7、Cb1家族調控TAM及Bufalin/TRAIL誘導凋亡的機制
　　 為探討c-Cb1調節(jié)MCF-7細胞對TAM敏感性的機制,我們檢測了轉染野生型c-Cb1及其負突變體70Z/Cb1后細胞存活通路的變化。Western blot分析顯示,上調c-Cb1的表達水平可明顯抑制基礎及TAM誘導的c-Src、ERK、AKT的活性,抑制c-Cb1的泛素連接酶功能可解除對c-S

18、rc、ERK、AKT活性的抑制作用。
　　 為探討B(tài)ufalin作用后DR4/DR5表達變化的機制,我們檢測了“沉默”Cb1-b后DR4/DR5表達的變化。Western blot分析顯示“沉默”Cb1-b后提高了Bufalin誘導的DR4/DR5上調幅度,進一步研究發(fā)現Cbl-b的下調解除了其對ERK、JNK、p38活性的抑制,進而導致了DR4/DR5上調。
　　 結論：
　　 1.TAM以時間和劑量依賴的方式

19、抑制乳腺癌MCF-7增殖,誘導細胞凋亡。
　　 2.c-Sre、ERK及AKT在TAM誘導MCF-7細胞凋亡過程中發(fā)揮了保護性作用。
　　 3.乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞均對TRAIL耐藥,Bufalin可明顯增強乳腺癌細胞對TRAIL敏感性。
　　 4.Bufalin通過上調死亡受體DR4/DR5的表達水平增強乳腺癌細胞對TRAIL的敏感性。
　　 5.Bufalin通過活化MAPKs(