1、研究背景和目的: 結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近十年來(lái)，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和死亡的主要原因，探討與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，尋找有效、特異的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并探討其功能，不僅有利于闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，還能為臨床診治、藥物篩選及預(yù)后判斷提供新的靶點(diǎn)。 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transitions，EMT）是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細(xì)

2、胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，并獲得遷移能力，它是一種基本的生理病理現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生中起重要作用。此外，EMT也存在于多種病理過(guò)程中，如傷口愈合過(guò)程、腎臟纖維化、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。越來(lái)越多的研究顯示EMT在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，因而已成為腫瘤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。 在我們的前期研究中，我們篩選出了Formins家族成員之一的FMNL2基因作為一個(gè)研究結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。目前有關(guān)FMNL2的研究文獻(xiàn)僅有數(shù)篇，

3、主要是針對(duì)FMNL2的克隆、進(jìn)化及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，而對(duì)于FMNL2功能學(xué)尤其是腫瘤方面的研究除本課題組外，尚未見(jiàn)其它報(bào)道。我們課題組首次探討了FMNL2在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，結(jié)果顯示FMNL2與結(jié)直腸的癌侵襲、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。FMNL2通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及侵襲。 FMNL2是否與結(jié)直腸癌EMT有關(guān)？文獻(xiàn)報(bào)道RhoA是參與腫瘤EMT的一個(gè)重要調(diào)控因子。結(jié)直腸癌細(xì)胞干擾FMNL2后，其形態(tài)

4、發(fā)生改變，由梭形、類(lèi)似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)變成典型的圓形或卵圓形，該形態(tài)的變化有可能是由間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）引起。FMNL2干擾前后的基因芯片結(jié)果顯示多個(gè)與EMT相關(guān)的分子（如Paxillin、MAPK、AKT、P13K等）的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，主要涉及了PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK兩種途徑。由此我們推測(cè)：FMNL2可能在結(jié)直腸癌EMT中發(fā)揮重要作用。 本研究重點(diǎn)探討FMNL2基因與結(jié)直腸癌EMT的關(guān)系及其參與的

5、信號(hào)通路，旨在揭示FMNL2參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新途徑，增加對(duì)FMNL2這個(gè)功能未知基因的新認(rèn)識(shí)，為腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供新線索。 方法: 1.FMNL2和EMT標(biāo)志物在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)及其相關(guān)性。 應(yīng)用免疫組化S-P法，檢測(cè)4種轉(zhuǎn)移能力不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW620、SW480/M5、SW480、HT29）、138例結(jié)直腸癌和相應(yīng)的30例正常結(jié)直腸黏膜組織中FMNL2、EMT上皮標(biāo)記物（E-cadh

6、erin、CK）與間質(zhì)標(biāo)記物（Vimentin）蛋白的表達(dá)情況，分析其相關(guān)性。 應(yīng)用熒光定量RT-PCR，分別檢測(cè)FMNL2、EMT上皮標(biāo)志物（E-cadherin）與間質(zhì)標(biāo)志物（Vimentin）mRNA在4種轉(zhuǎn)移能力不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW620、SW480/M5、SW480、HT29）中的表達(dá)情況。 2.FMNL2沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的影響。 利用已構(gòu)建的FMNL2干擾載體，通過(guò)G418篩選獲得FMN

7、L2干擾抗性單克隆，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再用熒光定量RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定干擾的效果。應(yīng)用熒光定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)FMNL2沉默后，EMT上皮標(biāo)記物（E-cadherin、α-catenin、γ-catenin），間質(zhì)標(biāo)記物（Vimentin、Nβ-cateinin）和轉(zhuǎn)錄因子（Snail、Slug）的變化。 3. FMNL2沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的影響。 利用外源性TGF-β

8、1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞株（M5/mock、M5/FMNL2-）及犬腎上皮MDCK細(xì)胞株（該細(xì)胞株通用于EMT的研究）發(fā)生EMT變化，觀察其形態(tài)學(xué)改變，運(yùn)用熒光定量RT-PCR檢測(cè)FMNL2、E-Cadherin和Vimentin的mRNA變化；利用Western blot檢測(cè)EMT上皮標(biāo)記物（E-cadherin、α-catenin、γ-catenin），間質(zhì)標(biāo)記物（Vimentin、Nβ-catenin）和轉(zhuǎn)錄因子（Snail、Slug）

9、的表達(dá)變化。 4. FMNL2參與結(jié)直腸癌EMT的可能信號(hào)通路。 運(yùn)用熒光定量PCR對(duì)芯片中一些靶點(diǎn)進(jìn)FMNL2干擾前后進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證基因芯片的可靠性。利用Western Blot檢測(cè)FMNL2沉默后結(jié)直腸癌細(xì)胞中EMT相關(guān)信號(hào)蛋白PI3K、AKT、MAPK、MEK以及對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT、P-MAPK、P-MEK的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.FMNL2和EMT標(biāo)志物在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞株

10、中的表達(dá)及其相關(guān)性 在高轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620和SW480/M5中，F(xiàn)MNL2和間質(zhì)標(biāo)志物（Vimentin）的表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞株SW480和HT29；而EMT上皮標(biāo)志物（E-cadherin和CK）的表達(dá)低于SW480和HT29。 FMNL2、Vimentin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于正常粘膜組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)高于結(jié)直腸癌組織（P<0.05），而上皮標(biāo)志物E-cadherin、CK在正常粘膜

11、中的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸癌及淋巴結(jié)組織（P<0.05）。通過(guò)相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)FMNL2與E-cadherin、CK呈負(fù)相關(guān)（r=-0.377； P=0.000； r=-0.327，P=0.000），而與間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.503，P=0.000）。以上結(jié)果提示FMNL2與結(jié)直腸癌EMT相關(guān)，可能通過(guò)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。 2.FMNL2沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT的影響。 FMNL2的

12、干擾效率達(dá)75%以上。FMNL2沉默后，結(jié)直腸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了改變，由梭形、類(lèi)似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)變成的典型的圓形或卵圓形；EMT上皮標(biāo)記物E-cadherin、α-catenin、γ-catenin表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin和Nβ-catenin表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達(dá)量均下調(diào)。以上結(jié)果提示外源性的FMNL2能促使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。 3. FMNL2沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞EM

13、T的影響。 利用外源性TGF-β1刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞株（M5/mock、M5/FMNL2-）及犬腎上皮MDCK細(xì)胞株48小時(shí)左右，三種細(xì)胞形態(tài)學(xué)均發(fā)生明顯的改變。MDCK由圓形、卵圓形變成梭形、成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn)典型的EMT改變。常規(guī)培養(yǎng)時(shí)M5/mock細(xì)胞多呈梭形、類(lèi)似成纖維細(xì)胞，而M5/FMNL2-細(xì)胞多呈圓形、卵圓形的上皮樣細(xì)胞；TGF-β1刺激后，M5/mock細(xì)胞幾乎都變成間質(zhì)樣的細(xì)胞，而M5/FMNL2-細(xì)胞

14、部分轉(zhuǎn)變成間質(zhì)樣的細(xì)胞，還可見(jiàn)一定數(shù)量的上皮樣細(xì)胞，相對(duì)于M5/mock細(xì)胞，M5/FMNL2-細(xì)胞轉(zhuǎn)化成梭形、間質(zhì)樣的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 熒光定量PCR結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，三種細(xì)胞的上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)均下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin的表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)MNL2的表達(dá)也有不同程度的上調(diào)；M5/mock細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化強(qiáng)于M5/FMNL2-細(xì)胞。Western blo

15、t結(jié)果顯示三種細(xì)胞TGF-β1刺激之后上皮標(biāo)記物E-Cadherin、α-Catenin和γ-Catenin表達(dá)均下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin和Nβ-catenin表達(dá)均上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達(dá)量均上調(diào)；M5/mock細(xì)胞中所檢測(cè)蛋白的表達(dá)變化強(qiáng)于M5/FMNL2-細(xì)胞。以上結(jié)果提示FMNL2能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。 4. FMNL2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中EMT相關(guān)信號(hào)通路中的調(diào)控作用。 熒光定量PCR

16、驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。FMNL2沉默后EMT相關(guān)信號(hào)分子PI3K、AKT、MAPK、MEK、P-PI3K、P-AKT、P-MAPK、P-MEK蛋白表的達(dá)均下調(diào)，提示FMNL2可能是通過(guò)PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK兩條信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。 結(jié)論： 1.轉(zhuǎn)移相關(guān)基因FMNL2與結(jié)直腸癌EMT相關(guān)； 2.轉(zhuǎn)移相關(guān)基因FMNL2可能通過(guò)PI3K-AKT和Ras-MEK-MAPK兩條通路促進(jìn)