1、本實(shí)驗(yàn)利用RACE-PCR技術(shù)克隆了蛤仔HSP60基因全長(zhǎng)，結(jié)果表明，蛤仔 HSP60 cDNA全長(zhǎng)1777bp(含ploy A序列)，GenBank登錄號(hào)：KT987978，包括1728bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，21bp的5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)和49bp的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)，編碼575個(gè)氨基酸，推導(dǎo)蛋白分子量(Mw)為61.25 kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.04，N末端無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與已知

2、的HSP60基因序列同源性較高(80％)。
　　本研究成功克隆了菲律賓蛤仔的HSP60基因全長(zhǎng)，為進(jìn)一步深入研究蛤仔的抗逆機(jī)理及其遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，對(duì)HSP40、60、90基因在野生及3種殼色品系（海洋橙、斑馬、白蛤）蛤仔的血細(xì)胞、閉殼肌、外套膜、足、鰓和消化腺中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示： HSP40、60、90在野生和3種殼色蛤仔不同組織均有表達(dá)。以外套膜中的表達(dá)量為對(duì)照組，其中，HSP40

3、基因在野生和3種殼色鰓組織中表達(dá)水平最高（p<0.01），而在閉殼肌中的表達(dá)水平最低；HSP60基因在野生、海洋橙和斑馬蛤血細(xì)胞中表達(dá)量水平最高(p<0.01)，在白蛤鰓組織中表達(dá)水平最高(p<0.01)，在野生和3種殼色蛤仔閉殼肌中的表達(dá)水平最低；HSP90基因在野生和斑馬蛤血細(xì)胞中的表達(dá)量水平最高(p<0.01)，在海洋橙和白蛤鰓組織中的表達(dá)量最高(p<0.01)，在野生和3種殼色閉殼肌中的表達(dá)水平最低。表明蛤仔HSPs基因家族具有

4、組織特異性的表達(dá)模式。研究低鹽（15）環(huán)境下HSP40、60、90在不同殼色品系蛤仔鰓組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HSP40基因在野生、斑馬蛤和海洋橙殼色個(gè)體鰓組織中表達(dá)量變化表現(xiàn)出相同的規(guī)律，均為先升高后下降，又升高達(dá)到最高表達(dá)量的過(guò)程；在白蛤個(gè)體的表達(dá)量則為先下降后升高的過(guò)程。并且，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，海洋橙鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量都高于其它三種殼色；HSP60基因在野生蛤仔鰓組織中表達(dá)量變化為先上升后下降后又上升的過(guò)程，在海洋橙蛤鰓組織中表

5、達(dá)量則表現(xiàn)為逐漸上升并在96h時(shí)達(dá)到最高值（p<0.01），在斑馬和白蛤鰓組織表達(dá)量變化為逐漸升高分別在24h，72h達(dá)到最高而后逐步恢復(fù)的過(guò)程；HSP90基因在野生、斑馬、白蛤鰓組織表達(dá)量變化為先上升后分別在72h，12h，72h到達(dá)較高值而后逐漸恢復(fù)，在海洋橙體內(nèi)其表達(dá)量變化未顯示出規(guī)律性,說(shuō)明低鹽可以誘導(dǎo)HSP40、60、90基因的高表達(dá)。研究了高溫和低溫（30℃、-1℃）脅迫對(duì)不同品系蛤仔HSP40、60、90表達(dá)的影響。結(jié)果表

6、明：在受到高溫脅迫后，HSP40表達(dá)量在不同殼色蛤仔鰓組織中表現(xiàn)出相同的變化過(guò)程，即為先逐步升高而后逐漸恢復(fù)，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，海洋橙的表達(dá)程度均高于其它三種殼色；HSP60表達(dá)量在野生、海洋橙和白蛤的鰓組織中均表現(xiàn)為逐步升高而后逐漸恢復(fù)到正常水平，其中在野生蛤仔內(nèi)6h達(dá)到最高值（p<0.05），而在海洋橙和白蛤96h達(dá)到最高表達(dá)量（海洋橙p<0.05，白蛤p<0.01）。斑馬蛤0-24h維持在較低水平，在48h出現(xiàn)一次高表達(dá)量，96h達(dá)

7、到最高表達(dá)量（p>0.05）；HSP90在4種殼色蛤仔鰓組織中表達(dá)量變化表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，0-6h持續(xù)升高到最高表達(dá)量后下降至正常水平。受到低溫脅迫后，HSP40表達(dá)量在野生群體鰓組織中呈先上升后下降的趨勢(shì)，在6h達(dá)到最高表達(dá)量（p<0.05）；海洋橙和斑馬蛤鰓組織中呈先下降后上升趨勢(shì)，在24h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量（p<0.05）；白蛤鰓組織中0-24h表達(dá)量基本保持不變，在48h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量（p<0.05）。HSP60表達(dá)量在野生群體鰓

8、組織中表達(dá)量基本不變，與空白組持平；海洋橙鰓組織0-24h表達(dá)量不變，48h出現(xiàn)高表達(dá)量（p<0.01）；斑馬蛤鰓組織表達(dá)量持續(xù)下降，72h恢復(fù)正常水平；白蛤鰓組織表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，48h達(dá)到最高表達(dá)量（p<0.05）。HSP90表達(dá)量在野生群體鰓組織中持續(xù)下降，96h恢復(fù)正常水平,6h、12h顯著低于空白組(p<0.05)；海洋橙鰓組織中持續(xù)上升，在48h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量(p<0.05)，72-96h表達(dá)量緩慢下降。斑馬蛤鰓組織0-4