1、CD28分子的基因定位于人2號(hào)染色體q33-34區(qū)，由1120核苷酸組成，表達(dá)于大多數(shù)靜止及活化的T細(xì)胞，約95％CD4+T和50％CD8+T細(xì)胞表達(dá)該分子。此外，部分NK細(xì)胞和人惡性漿細(xì)胞也表達(dá)CD28分子。B7-1(CD80)和B7-2(CD86)是CD28的天然配體，CD28分子與表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞表面的相應(yīng)配體B7-1和B7-2結(jié)合，從而產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答所需的協(xié)同刺激信號(hào)。B7-CD28信號(hào)并非僅局限性地產(chǎn)生于抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞

2、之間，已在某些腫瘤細(xì)胞如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，白血病細(xì)胞等也發(fā)現(xiàn)異常的B7-CD28信號(hào)通路，且該通路可能參與腫瘤的惡性增殖與轉(zhuǎn)移。通過(guò)特異性抗體封閉CD28分子，有可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用。本研究旨在運(yùn)用自行制備的CD28抗體，以轉(zhuǎn)染人CD28基因的小鼠T淋巴瘤細(xì)胞株及天然表達(dá)CD28分子的人白血病細(xì)胞株Jurkat為研究對(duì)象，在體外分析抗體對(duì)上述細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖影響的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立腫瘤模型，探討抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的成瘤及腫瘤消長(zhǎng)的影

3、響，以期尋找具有抗瘤作用的生物制劑。
　　 第一部分鼠抗人CD28分子單克隆抗體的制備及鑒定
　　 目的：制備鼠抗人CD28分子單克隆抗體并鑒定其生物學(xué)功能。
　　 方法：采用本室建立的腹水誘生法制備單抗并經(jīng)Protein G親和層析分離純化。間接免疫熒光法分析單克隆抗體效價(jià)；FCM分析單克隆抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)；FCM分析單克隆抗體對(duì)不同細(xì)胞株人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(U266)、小鼠淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入CD28基因細(xì)胞株(

4、CD28-T)和人白血病細(xì)胞株(Jurkat)膜型CD28分子的識(shí)別。
　　 結(jié)果：腹水形成率為90％以上，收獲量為5ml/只以上。腹水中抗體蛋白的得率達(dá)3mg/ml。純化抗體用于間接免疫熒光檢測(cè)的用量為0.5μg/5×105。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)表明該單抗能完全阻斷標(biāo)準(zhǔn)鼠抗人CD28抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合，提示其識(shí)別的抗原表位與對(duì)照抗體相同或相似。FCM分析表明，CD28 mAb能良好地識(shí)別多種細(xì)胞表面膜型CD28分子。
　　

5、結(jié)論：制備了鼠抗人CD28分子mAb(命名為SQA-11)，為探討CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 第二部分 SQA-11與腫瘤細(xì)胞膜型CD28結(jié)合后介導(dǎo)的效應(yīng)研究
　　 目的：探討SQA-11體內(nèi)、外對(duì)CD28+腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖的影響作用，以期尋找具有抗瘤作用的生物制劑。
　　 方法：MTT法體外分析SQA-11對(duì)CD28-T和Jurkat生長(zhǎng)和增殖的影響；建立CD2

6、8-T與Jurkat細(xì)胞的Balb/c裸鼠的腫瘤模型，F(xiàn)CM分析成瘤小鼠瘤體細(xì)胞CD28分子的表達(dá)；將CD28-T與Jurkat分別經(jīng)SQA-11預(yù)處理后再行建立腫瘤模型，觀察成瘤時(shí)間和成瘤率，同時(shí)與未經(jīng)抗體處理組進(jìn)行比較。將腫瘤模型隨機(jī)分組，采用瘤內(nèi)注射法將SQA-11分2-3點(diǎn)、隔日一次共4次注入瘤內(nèi)，抗體用量為50μg/mm3觀察腫瘤的消長(zhǎng)及荷瘤鼠的生存狀態(tài)。
　　 結(jié)果：MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SQA-11能夠明顯抑制CD28-T

7、和Jurkat細(xì)胞的體外增殖。CD28-T細(xì)胞于接種第3天即形成肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，且成瘤率為100％(40/40)。Jurkat細(xì)胞于接種第14天后陸續(xù)形成肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率為80％(32/40)。對(duì)接種第40天的腫瘤結(jié)節(jié)中的細(xì)胞經(jīng)FCM進(jìn)行分析，CD28的陽(yáng)性率分別為CD28-T90.4％、Jurkat74.3％。與未接種前體外培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)明顯差異。CD28-T與Jurkat細(xì)胞分別經(jīng)SQA-11共孵育后接種小鼠，CD28-

8、T的成瘤時(shí)間推遲2天即第5天形成肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率仍為100％(20/20)；Jurkat細(xì)胞的成瘤時(shí)間推遲5天即第19天開(kāi)始形成腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率為50％(10/20)。將CD28-T(第7天)及Jurkat(第30天)腫瘤模型用SQA-11瘤內(nèi)注射，觀察40天。Jurkat模型組部分(3/10)裸鼠的腫瘤結(jié)節(jié)變小，平均體積由注射時(shí)的56mm3減為32mm3；對(duì)CD28-T模型組腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。
　　 結(jié)論：S