1、背景與目的
　　急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是由多種原因引起的嚴(yán)重肝臟損害,其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能嚴(yán)重障礙或失代償,出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙和黃疸、肝性腦病和腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。病情進(jìn)展迅速,病死率高達(dá)80％,嚴(yán)重威脅人們健康。在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家,嗜肝病毒感染尤其是乙型肝炎病毒(HBV)感染則是最主要的原因。肝衰竭的發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚,治療仍為臨床上的一大難點(diǎn)。了解肝衰竭的發(fā)病

2、機(jī)制可為臨床早期診斷提供新的分子生物學(xué)指標(biāo),為臨床治療提供新的治療方向及作用靶點(diǎn)。
　　微小RNA(micmRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸。在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)500個(gè)miRNA編碼基因,預(yù)測(cè)可調(diào)控約5300個(gè)基因。miRNA主要與靶mRNA的3'UTR結(jié)合,引起靶mRNA沉默,起負(fù)調(diào)控作用。近年來(lái),miRNA的研究是國(guó)際上的一大熱點(diǎn),其原因是這些普遍存在的小分子在真核基

3、因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用,盡管對(duì)miRNA的研究還處于初級(jí)階段,據(jù)推測(cè)miRNAs在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要,miRNA可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。
　　生物信息學(xué)方法數(shù)據(jù)庫(kù)如GO(Gene ontology)和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)可有效地預(yù)測(cè)復(fù)雜的細(xì)胞生物功能及信號(hào)通路。生物信息學(xué)已被成功應(yīng)用于miRNA在

4、心臟疾病和肝纖維化中功能的預(yù)測(cè)研究之中。
　　目前miRNAs在ALF中的表達(dá)譜以及miRNA與肝細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中,我們利用ALF小鼠模型深入研究了miRNAs在ALF中的表達(dá)譜及其對(duì)肝細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制。
　　方法
　　1.急性肝衰竭小鼠模型的建立及miRNA表達(dá)譜的研究:目的是用D-GalN/LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠建立急性肝衰竭模型,為研究miRNA在急性肝衰竭中的調(diào)控作用提供穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物

5、模型。BALB/C小鼠,隨機(jī)分為四組,以D-氨基半乳糖(D-GalN,900mg/kg)聯(lián)合脂多糖(LPS,10μg/kg)腹腔注射建立急性肝衰竭為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組分別予以D-GalN900mg/kg、LPS10μg/kg以及生理鹽水,在不同時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠死亡率,給藥后0、1、3、5、7、9小時(shí)分別留取小鼠血清、肝臟組織標(biāo)本。H&E染色檢測(cè)肝臟病理學(xué)變化,免疫組化方法檢測(cè)肝臟肝細(xì)胞凋亡,ELISA方法檢測(cè)血清中炎癥因子的表達(dá),生化分析儀檢

6、測(cè)血清中ALT、AST水平。miRNA micmarray檢測(cè)小鼠肝臟microRNA的表達(dá)譜。
　　2.miRNAs在急性肝衰竭小鼠中調(diào)控作用的生物信息學(xué)分析:基于microarray結(jié)果,對(duì)在急性肝衰竭中持續(xù)發(fā)生變化(上調(diào)或下調(diào))的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以便深入了解miRNAs在肝衰竭中具體的調(diào)控作用。利用基因本體論(GO)方法對(duì)基因進(jìn)行顯著性的功能分析,從而得到顯著性的GO。由顯著性GO與基因的關(guān)系,及microR

7、NA與基因的關(guān)系,就可以得到miRNA與顯著性的GO之間的關(guān)系。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes orthology)信號(hào)通路分析是對(duì)基因參與的所有信號(hào)通路進(jìn)行顯著性的分析,根據(jù)miRNAs和基因的關(guān)系,從而得到miRNAs在信號(hào)通路中的調(diào)控作用。同時(shí)我們用差異miRNAs調(diào)控的基因與miRNA的屬性關(guān)系來(lái)建立miRNA-gene作用網(wǎng)絡(luò)
　　3.miR-15b/16在急性肝

8、衰竭肝細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用研究:D-GalN(1 mg/m1)聯(lián)合TNF(100 ng/m1)體外誘導(dǎo)小鼠胚胎肝細(xì)胞BNLCL2凋亡,流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡。RT-PCR檢測(cè)miR-15b/16及TNF在凋亡細(xì)胞中的表達(dá),利用miR-15b/16阻遏物(inhibitor)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,進(jìn)一步研究miR-15b/16對(duì)引起肝細(xì)胞凋亡的中心因子TNF以及抗凋亡因子BCL2的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.D-GalN/LPS給藥后5

9、h小鼠開(kāi)始死亡,9h死亡率為50％,24小時(shí)死亡率達(dá)80％,而對(duì)照組無(wú)一例死亡。肝組織在病變?cè)缙?3小時(shí)前)肝臟點(diǎn)狀出血,5小時(shí)肝組織炎癥加重,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生,晚期(7小時(shí)后)可見(jiàn)大量肝細(xì)胞壞死,整個(gè)肝臟淤血,無(wú)肝小葉結(jié)構(gòu)。給藥1小時(shí)ALT和AST無(wú)明顯變化,1小時(shí)后表達(dá)開(kāi)始上升,7小時(shí)達(dá)到高峰(和對(duì)照組比較P＜0.01),7小時(shí)后因肝細(xì)胞大量壞死,血清中ALT、AST水平急驟下降。血清中TNF-

10、a和IL-6的表達(dá)水平和肝臟中mRNA的水平基本一致,正常小鼠體內(nèi)微量表達(dá)TNF-a和IL-6,為機(jī)體正常發(fā)育生長(zhǎng)所必需,D-GalN/LPS誘導(dǎo)后其表達(dá)均發(fā)生了變化,給藥后血清中TNF-a和肝臟TNF-a mRNA水平均表達(dá)上調(diào)(和0小時(shí)相比各時(shí)間點(diǎn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p＜0.05),其中1小時(shí)上升達(dá)到一個(gè)高峰(p＜0.01),7小時(shí)再次達(dá)到一個(gè)高峰(p＜0.01);IL-6發(fā)生了與TNF-a類似的變化。為了明確miRNA在急性肝衰

11、竭中表達(dá)及可能發(fā)揮的作用,采用基于LNA技術(shù)的miRNAmicroarray分析發(fā)現(xiàn),在急性肝衰竭體內(nèi)有122個(gè)miRNAs發(fā)生了變化,95個(gè)miRNAs變化明顯(P＜0.01)。
　　2.基于microarray結(jié)果分析得到,急性肝衰竭模型組給藥后95個(gè)miRNAms發(fā)生顯著變化,其中5小時(shí)和7小時(shí)均發(fā)生上調(diào)的有20個(gè),下調(diào)的有26個(gè),49個(gè)miRNAs變化波動(dòng)。為了進(jìn)一步明確變化miRNAs在急性肝衰竭哪些信號(hào)通路中發(fā)揮作用及

12、其對(duì)哪些功能進(jìn)行調(diào)控,我們對(duì)5小時(shí)和7小時(shí)均發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)基因本體論(GO,Gene Ontology)分析,基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其靶基因進(jìn)行信號(hào)通路(pathway)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),59個(gè)GO發(fā)生顯著性變化,包括:apoptosis,anti-apoptosis,immuneresponse,protein kinase cas

13、cade,cell cycle,cell adhesion,intracellularsignalling cascade,TGF-receptor signalling pathway and DNA repair等,而MAPK signalling pathway,cell cycle,cytokine-cytokine receptor interactionand apoptosis等信號(hào)通路則具有較高的富集值。
　　根據(jù)

14、以上GO和KEGG生物信息學(xué)分析結(jié)果構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNAs如miR-15b,-16,-155,-21,-125a/b-5p,-26b和下調(diào)的miRNAs如miR-466f-3p,-467f,-574-5p,-93,-1187,-145,Let-7b,-329 and-24和凋亡相關(guān)。
　　3.從microarray數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miRNAs在凋亡通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,而miR-1

15、5b/16共同作用于凋亡基因BCL2。Luciferase和westem-blot進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)結(jié)果得到BCL2為miR-15b/16的靶基因。體外模擬體內(nèi)小鼠肝衰竭誘導(dǎo)條件,利用D-GalN/TNF誘導(dǎo)肝胚胎細(xì)胞BNLCL2凋亡過(guò)程中發(fā)現(xiàn),miR-15b/16表達(dá)上調(diào),體外用miR-15b/16阻遏物(inhibitor)可有效減輕肝細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞內(nèi)TNF-a mRNA的表達(dá),細(xì)胞上清液中TNF-a的含量也隨之下降,而細(xì)胞中