1、背景及目的： 目前大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)HBx片斷可在多數(shù)并發(fā)乙肝病毒感染的肝癌組織中檢測(cè)到，它是肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要因素之一，并可提高肝癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞快速增長(zhǎng)。因此，高效特異的基因治療新技術(shù)RNA干擾靶向沉默HBx基因的應(yīng)用是肝癌治療的一種新方法。另一方面，化療仍是目前肝癌治療重要手段之一，但多種化療藥物耐藥性是肝癌治療失敗的主要原因。而相關(guān)研究表明，HBx片斷可通過特異MAPK途徑上調(diào)多藥耐藥基因的表達(dá)，并使抗

2、凋亡信號(hào)占主導(dǎo)地位，抑制化療藥物誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。因此我們擬采用針對(duì)HBx的RNA干擾技術(shù)與常用的肝癌化療藥物或抗腫瘤藥協(xié)同應(yīng)用，探討RNA干擾技術(shù)和傳統(tǒng)的治療方法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的影響，并選擇高效的治療組合，研究其凋亡機(jī)制。 方法： 1.鑒定轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)的對(duì)照序列(HK3細(xì)胞)和針對(duì)X基因shRNA(21543細(xì)胞)的穩(wěn)定肝癌細(xì)胞株：復(fù)蘇三種肝癌細(xì)胞(MHCC97-H，HK3，21543細(xì)胞)，在含有一定

3、濃度G418的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，初步估計(jì)轉(zhuǎn)染效率并拍照。 2.RT-PCR檢測(cè)RNA干擾對(duì)HBx基因mRNA沉寂的程度：收集細(xì)胞提取總RNA，加用兩對(duì)不同引物參照說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，根據(jù)凝膠電泳中內(nèi)源基因片段條帶的強(qiáng)弱，來(lái)判定模板的量，進(jìn)而判斷HBX基因的mRNA被siRNA沉寂的程度。 3.觀察RNA干擾后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：利用CCK8(Cell countingkit-8)

4、測(cè)定光密度值，繪制三種不同細(xì)胞6天的不同增殖曲線。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。 5.繪制加用三種不同濃度的5-氟脲嘧啶，順鉑，α-干擾素的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，選擇最佳組合。 6.TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)和GFP表達(dá)強(qiáng)度差別不大。 2.RT-PCR結(jié)果顯示相對(duì)于MHCC-97H細(xì)胞，21543細(xì)胞的HBxmRNA水平的下調(diào)顯著，HK3細(xì)胞

5、的HBx mRNA水平的下調(diào)不明顯。 3.靶向HBX的RNA干擾后的肝癌細(xì)胞(21543細(xì)胞)較原肝癌細(xì)胞(MHCC97-H細(xì)胞)和轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)對(duì)照序列的肝癌細(xì)胞(HK3細(xì)胞)增殖明顯減慢，后兩種細(xì)胞差別不顯著。 4.21543細(xì)胞的細(xì)胞周期顯示RNA干擾后的肝癌細(xì)胞延緩進(jìn)入S期，增殖活性明顯降低。 5.三種不同細(xì)胞加用三種不同濃度的5-氟脲嘧啶，順鉑后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，并呈濃度依賴性，以RNA干擾HBx后的肝癌細(xì)胞

6、(21543細(xì)胞)生長(zhǎng)抑制最明顯，加用干擾素后細(xì)胞抑制不明顯。 6.相同濃度的化療藥物5-氟脲嘧啶作用上述三種不同肝癌細(xì)胞均可引起細(xì)胞凋亡，以RNA干擾后的肝癌細(xì)胞(21543細(xì)胞)最為明顯。 結(jié)論： 1.RNA干擾HBx可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，細(xì)胞周期發(fā)生改變。 2.RNA干擾HBx后的肝癌細(xì)胞可明顯增強(qiáng)化療敏感性。 3.RNA干擾HBx和化療藥物二者聯(lián)合應(yīng)用肝癌細(xì)胞凋亡更為明顯，細(xì)胞增殖明顯