1、本研究將微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物材料學(xué)等多個(gè)學(xué)科有機(jī)結(jié)合起來(lái)，采用基于表位的疫苗設(shè)計(jì)的方法，運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了治療性的乙肝DNA疫苗；并對(duì)疫苗的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究；輔以納米的基因疫苗運(yùn)載體統(tǒng)后，將制備好的疫苗納米緩釋系統(tǒng)免疫小鼠，初步考察疫苗激發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究包括五個(gè)部分： 第一章疫苗的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 本研究是基于表位的疫苗設(shè)計(jì)(EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EB

2、VD)，以多表位基因疫苗的方式入手，構(gòu)建HBV基因疫苗。首先篩選靶抗原，即通過(guò)高分辨率的表位圖譜及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的手段預(yù)測(cè)并篩選表位，選取一組具有較強(qiáng)免疫原性的多種殺傷性T細(xì)胞表位及B細(xì)胞表位，進(jìn)行有機(jī)的組合；輔以一定的旁側(cè)序列連接這些表位以保證在真核細(xì)胞中能正確表達(dá)并加工成有效的多肽片段。 pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒是FDA批準(zhǔn)的能用于臨床試驗(yàn)的載體，含有豐富的CpG序列，通過(guò)化學(xué)合成得到目的基因片斷，并采用限制性?xún)?nèi)切酶技術(shù)和基因

3、重組技術(shù)將目的片斷克隆入pVAX1真核表達(dá)載體，通過(guò)酶切、PCR及測(cè)序的方法鑒定目的片斷已成功插入，得到重組質(zhì)粒pVAX/HS，為下一步工作奠定了基礎(chǔ)。 第二章疫苗的發(fā)酵與純化工藝的研究 從培養(yǎng)基配方、pH值及溶氧等方面對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，用層析的方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模純化，以得到大量的疫苗產(chǎn)品來(lái)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要。 首先采用了單因素考察的實(shí)驗(yàn)方法，找到了適合的碳源、氮源、磷源、鎂離子及較適水平，考慮到各因素間可能存

4、在的交互影響作用，運(yùn)用SAS軟件安排中心組合實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面分析，回歸擬合中心組合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得到能與實(shí)際情況擬合良好的模型方程，進(jìn)而可知最適的培養(yǎng)基成份。其次，在搖瓶分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵研究。發(fā)現(xiàn)溶氧與底物消耗密切相關(guān)，建立了利用溶氧反彈來(lái)確定補(bǔ)料時(shí)機(jī)的模式，并在20L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用恒速流加甘油的方式可以在一定程度上解除高濃度底物的抑制效應(yīng)，提高甘油的利用率，同時(shí)使菌體處于合適的底物濃度。最后，

5、通過(guò)分子篩與陰離子交換層析的方法，去除裂菌后質(zhì)粒疫苗中的宿主RNA、開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒DNA及內(nèi)毒素等主要污染物。 本實(shí)驗(yàn)得到的攜帶有質(zhì)粒疫苗的工程菌較適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)：甘油1.0、蛋白胨33.1、酵母抽提物5.0、KH2PO4 13.7、MgSO4.7H2O1.5。經(jīng)優(yōu)化后，生物量在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上提高了2.8倍。采用該模式進(jìn)行補(bǔ)料取得了良好的效果，得到生物量達(dá)69.8g/L，比批次發(fā)酵提高22％。通過(guò)層析的方法，去除了

6、主要雜質(zhì)，純化并濃縮得到了大量的目的基因質(zhì)粒。 第三章DNA疫苗質(zhì)量控制的研究 作為核酸疫苗的質(zhì)粒上設(shè)計(jì)有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌發(fā)酵來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，這為將來(lái)的產(chǎn)業(yè)化提供了可行性。核酸疫苗的生產(chǎn)涉及多步過(guò)程，如發(fā)酵、裂菌、柱層析分離純化目的產(chǎn)物等，在制備過(guò)程中采用無(wú)菌控制，柱層析時(shí)采用注射用水作為流動(dòng)相，從各個(gè)方面來(lái)盡量減少樣品的污染。根據(jù)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，疫苗制品的質(zhì)量控制多采用生物學(xué)分析方法，檢測(cè)結(jié)

7、果的準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于物理、化學(xué)測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)建立了準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)單易行的疫苗質(zhì)量檢定分析方法。 在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)前還必須對(duì)質(zhì)粒的含量、純度、殘余雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，檢定其是否合格，確定所制備質(zhì)粒合格才能進(jìn)行下一步工作。結(jié)合本核酸疫苗的發(fā)酵生產(chǎn)及純化制備過(guò)程的特點(diǎn)，大腸桿菌是G菌，可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，在破菌過(guò)程又會(huì)引入宿主核酸及蛋白的污染。因此本研究從內(nèi)毒素、蛋白殘量、RNA、超螺旋質(zhì)粒與開(kāi)環(huán)質(zhì)粒的比例這幾個(gè)方面對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行控制。

8、 第四章白蛋白納米粒-DNA疫苗制備的研究 本實(shí)驗(yàn)探討了治療性乙肝疫苗DNA/AL-NP(DNA/白蛋白納米粒)緩釋系統(tǒng)的制備、性質(zhì)及其介導(dǎo)DNA體外轉(zhuǎn)染的效果。采用改進(jìn)復(fù)凝聚法制備白蛋白納米粒，首先分別從乙醇、戊二醛的濃度及固化時(shí)間單因素考察對(duì)白蛋白納米粒粒徑及分散度的影響，然后采用正交設(shè)計(jì)考察幾個(gè)因素間的交互作用，發(fā)現(xiàn)在較優(yōu)化的條件下制備的納米粒其形態(tài)多為球形，平均粒徑為160nm；從pH值及DNA與白蛋白納米粒的配

9、比考察包封率，使包封率達(dá)96％，并在細(xì)胞外釋放具有緩釋的特征，且對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)無(wú)影響；DNA/AL-NP緩釋系統(tǒng)能在體外直接轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并表達(dá)出相應(yīng)的產(chǎn)物，表明對(duì)DNA的生物學(xué)活性沒(méi)有影響，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。 第五章白蛋白納米粒.乙肝DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫的研究 為了進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的DNA疫苗的免疫學(xué)活性，以及DNA/AL-NP基因疫苗緩釋系統(tǒng)對(duì)免疫效果的影響，我們進(jìn)行了小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將