1、已有研究支持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)存在感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMcs)等肝外組織的現(xiàn)象，并且在其中檢測到乙型肝炎病毒抗原及HBV DNA的復(fù)制。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)作為HBV基因組的原始復(fù)制模板，是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。HBV的病毒學(xué)特性是影

2、響其感染轉(zhuǎn)歸和抗病毒療效的最根本的原因，HBV cccDNA雖然量少，但十分穩(wěn)定，是HBV慢性感染以及抗病毒藥物停用后病情反復(fù)的主要因素。所以對(duì)ccoDNA的檢測便成為了解HBV能否在體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制的重要環(huán)節(jié)，國內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)和建立了一些HBV cccDNA的檢測方法，通過各種PCR技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RcA)等實(shí)驗(yàn)室手段能夠?qū)BMcs中的cccDNA進(jìn)行定性及定量檢測。
　　近

3、年核苷(酸)類抗病毒藥物的廣泛長期使用帶來了棘手的耐藥問題，已成為臨床抗病毒療效欠佳或失敗的主要原因。關(guān)于臨床上經(jīng)核苷(酸)類似物治療并產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA是否同樣存在類似的耐藥突變特點(diǎn)及其是否具有復(fù)制潛能，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用核苷(酸)類藥物選擇作用下產(chǎn)生的特定耐藥突變作為分子標(biāo)簽，重點(diǎn)比較分析了樣本血清HBV DNA和PBMCs HBV cccDNA RT區(qū)耐藥相關(guān)突變的差異以及對(duì)

4、PBMCs中HBVcccDNA復(fù)制力進(jìn)行測定，研究結(jié)果將有助于理解HBV肝外感染及耐藥相關(guān)機(jī)制。
　　目的分析經(jīng)核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清病毒中產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者PBMCs中HBV cccDNA的基因突變特點(diǎn)及其是否具有復(fù)制表達(dá)能力。
　　方法檢測分析了30例慢性乙型肝炎患者，均經(jīng)6個(gè)月以上的核苷(酸)類似物抗病毒治療并已在血清中產(chǎn)生耐藥突變。采集與血清檢測同一時(shí)間點(diǎn)的全血標(biāo)本30例并分離PBMCs，提

5、取總DNA，以不降解質(zhì)粒的ATP依賴的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP-dependent DNase，PSAD)消化+滾環(huán)擴(kuò)增+路缺口PCR方法擴(kuò)增HBV cccDNA的RT區(qū)，分析rtM204I、rtM204V、rtN236T、rtA181V、rt184、rt202或rt250等多個(gè)位點(diǎn)的核苷(酸)類似物耐藥相關(guān)突變。另外將擴(kuò)增的PBMCs中HBV cccDNA全長基因組克隆到pGEM-Teasy載體中，經(jīng)BspQⅠ/S

6、caⅠ雙酶切釋放的1.0倍HBV cccDNA全長基因組純化后，轉(zhuǎn)染入HepG2肝癌細(xì)胞，72小時(shí)后定量檢測HBsAg及核心顆粒DNA，分析PBMCs中HBV cccDNA全長基因組的自然復(fù)制力。
　　結(jié)果30例樣品中16例檢出HBV cccDNA，檢出率為53.3％，且PBMCs中HBV cccDNA檢出率與HBeAg陽性率、血清ALT水平及血清HBV DNA載量均無顯著相關(guān)性。在16例HBV cccDNA檢出者中，B基因型5例

7、，占31.3％；C基因型11例，占68.8％，與用血清HBV檢測分型結(jié)果一致；但與血清HBV均檢出耐藥突變不同，16例PBMCs cccDNA中檢出的病毒均是無核苷(酸)類似物耐藥突變的野生株。4例慢性乙肝患者中有3例從PBMCs中成功獲得全長cccDNA基因組的6條克隆進(jìn)行復(fù)制力檢測，通過ELISA法檢測上清HBsAg及實(shí)時(shí)定量PCR檢測核心顆粒DNA水平，表明其具有復(fù)制表達(dá)能力。
　　結(jié)論經(jīng)核苷酸類似物抗病毒治療的慢乙肝患者血