1、研究背景與目的：以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑在改善晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）療效與生活質(zhì)量中的作用已經(jīng)得到國際多中心臨床研究的充分肯定。研究證實：吉非替尼對具有EGFR激酶區(qū)域特征性突變的NSCLC（外顯子19缺失及外顯子21 L858R突變）患者療效顯著。但這些患者隨著治療時間的

2、延長，最終均不可避免地產(chǎn)生耐藥而導致疾病進展。此外，并非所有負載上述活性突變的NSCLC者均享有同等療效，部分病人即使初始有效卻極易發(fā)生耐藥。因此，闡明制約吉非替尼發(fā)揮藥效和產(chǎn)生耐藥的影響因素及其機制，探討與之協(xié)同的調(diào)節(jié)治療方法，創(chuàng)立新的聯(lián)合治療模式，對于更好發(fā)揮吉非替尼的藥效潛力，進一步提高肺癌的臨床治療水平，具有重要的意義與價值。本研究旨在解析NSCLC對吉非替尼耐藥的相關因素及可能的機制，研究細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine

3、 induced killer cells，CIK細胞）過繼輸注與吉非替尼聯(lián)合應用的意義，探討其作為一種新的臨床治療模式在克服耐藥、改善療效中的可能作用與地位。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 第一部分 吉非替尼對NSCLC的療效及其影響因素
　　 收集廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心接受吉非替尼250mg/天治療的33例NSCLC患者的外周血標本，及50例手術后復發(fā)的NSCLC患者的腫瘤組織標本（6例接受吉非替

4、尼治療的患者同時收集了外周血和腫瘤組織標本）。酶切富集PCR法分析EGFR基因外顯子19、21突變，比較性別、吸煙史對EGFR基因突變檢出及吉非替尼治療反應的影響；免疫組化檢測NSCLC患者組織標本中EGFR、p-Erk、p-Akt、p-Stat3和p53的表達，探討吸煙影響NSCLC患者吉非替尼治療反應的可能機制。
　　 第二部分 吉非替尼耐藥人肺腺癌PC-9細胞株的建立及其生物學特性
　　 選擇吉非替尼敏感的人肺腺癌

5、PC-9細胞株（EGFR基因外顯子19 E746-A750缺失，p53突變），采納大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導獲得吉非替尼耐藥株PC-9/GR。用CCK-8法檢測細胞的耐藥指數(shù)，測定細胞群體倍增時間和細胞生長曲線，軟瓊脂克隆形成試驗觀察細胞的體外克隆形成能力，PI染色法和Annexin-v/7-AAD雙標記法觀察細胞周期和細胞凋亡，探討吉非替尼對PC-9細胞和PC-9/GR細胞的治療反應，PCR直接測序法分析PC-9細胞和

6、PC-9/GR細胞EGFR基因外顯子19、20序列，Western blot法檢測PC-9細胞和PC-9/GR細胞EGFR信號轉(zhuǎn)導通路分子的表達，免疫細胞化學染色法檢測PC-9和PC-9/GR細胞p53蛋白表達。
　　 第三部分 CIK細胞對吉非替尼耐藥肺腺癌（PC-9/GR）細胞的殺傷效應研究
　　 應用細胞與裸鼠移植瘤實驗，比較觀察CIK細胞對PC-9和PC-9/GR細胞的殺傷率以及對移植瘤增殖的抑制效率，研究CIK

7、細胞與吉非替尼聯(lián)合應用對耐藥株PC-9/GR的協(xié)同殺傷效應。
　　 第四部分 CIK細胞輸注對腫瘤患者免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)
　　 為了進一步理解CIK細胞過繼回輸可能的免疫調(diào)節(jié)機制在應對耐藥中的地位，對4例惡性腫瘤患者共6個療程回輸CIK細胞治療后的免疫內(nèi)環(huán)境進行了動態(tài)觀察。CIK細胞過繼回輸采納新建的CO2循環(huán)供氣密閉波浪式CIK細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，流式細胞儀跟蹤CIK細胞的誘導分化，CCK-8法檢測CIK細胞體外殺傷K-562

8、腫瘤細胞活力，分別于患者接受CIK細胞輸注前、輸注后1天、1周、2周、1月采集EDTA抗凝外周血，應用流式細胞儀和液相芯片檢測分析免疫細胞亞群和細胞因子/趨化因子的動態(tài)變化。與此同時，對新建體系與靜置培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴增培養(yǎng)CIK細胞的效率進行了研究比較，并觀察了重組人IL-2撤除及凍存、復蘇對CIK細胞殺傷活性的影響，為建立高效、節(jié)能、具有質(zhì)量保障的CIK細胞臨床應用標準化規(guī)范流程提供可參照模板。
　　 結(jié)果：
　　 第一

9、部分 吉非替尼對NSCLC的療效及其影響因素
　　 33例接受吉非替尼治療的患者，總體客觀緩解率為42.4％，中位疾病無進展生存期為3.000（1.972～4.028）個月，單因素分析顯示血漿EGFR基因突變陽性的患者或不吸煙患者接受吉非替尼治療的客觀有效率和中位疾病無進展生存期高于血漿EGFR基因突變陰性的患者或吸煙患者，P<0.05；多因素回歸分析顯示血漿游離核酸EGFR基因突變?yōu)榧翘婺嶂委熆陀^緩解率的唯一獨立影響因素（P

10、=0.002），而血漿游離核酸EGFR基因突變（P=0.007）、吸煙史（P=0.040）均為疾病無進展生存期的獨立影響因素。
　　 在總共77例標本中，檢出EGFR基因突變35例（45.5％），其中不吸煙患者腫瘤組織樣本中EGFR基因突變明顯高于吸煙患者（56.1％ vs.33.3％，P=0.045），但性別對EGFR基因突變率沒有明顯影響；在50例肺癌組織中，p53突變蛋白檢出率為48.0％ (24/50)，EGFR表達陽性

11、率為48.0％ (24/50)，p-Akt蛋白陽性率為48.0％ (24/50)，p-Erk蛋白陽性率為36.0％ (18/50)，p-Stat3蛋白陽性率為24.0％ (12/50)。P53突變蛋白在吸煙患者(61.5％，16/26)和EGFR基因野生型患者(60.7％，17/28)中的表達顯著高于不吸煙患者(33.3％，8/24)和EGFR基因突變患者(31.8％，7/22)，P<0.05，而p-Akt、p-Erk、p-Stat3蛋

12、白的表達與吸煙史、EGFR基因突變未見明顯相關性；進一步分析吸煙對不同EGFR基因突變狀態(tài)NSCLC患者EGFR、p-Stat3、p-Erk、p-Akt、p53蛋白表達影響時發(fā)現(xiàn)，在EGFR基因野生型肺癌中，吸煙與否與p53突變蛋白的表達并無相關性；而在EGFR基因突變型肺癌，吸煙患者p53突變蛋白檢出率則明顯高于不吸煙者，75.0％ vs.7.1％，P=0.02，其他各組未見統(tǒng)計學明顯差異。
　　 第二部分 吉非替尼耐藥人肺腺

13、癌PC-9細胞株的建立及其生物學特性
　　 經(jīng)大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導，建立了能夠在10umol/L吉非替尼濃度下長期培養(yǎng)生長的細胞株，命名為肺腺癌吉非替尼耐藥株PC-9/GR。親本PC-9細胞群體細胞倍增時間是PC-9/GR細胞的1.64倍，經(jīng)CCK-8法檢測，PC-9/GR細胞的吉非替尼半數(shù)抑制濃度(IC50)是親代PC-9細胞的100.16倍，而對順鉑無交叉耐藥；吉非替尼作用后可呈劑量依賴性顯著抑制PC-

14、9的細胞增殖，誘導細胞G0/G1期周期阻滯和細胞凋亡，但對PC-9/G R細胞的作用較PC-9細胞明顯減低。
　　 第三部分 CIK細胞對吉非替尼耐藥肺腺癌（PC-9/GR）細胞的殺傷效應研究
　　 CIK細胞對PC-9和PC-9/GR細胞體外殺傷活性無明顯差異，CIK細胞輸注對PC-9和PC-9/GR細胞移植瘤的生長都有一定的抑制作用，腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤組織重量顯著減輕，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，P<0.0

15、5，但CIK細胞輸注對腫瘤的抑制率在PC-9和PC-9/GR移植瘤之間無統(tǒng)計學差異；CIK細胞和吉非替尼同時作用于PC-9/GR細胞呈現(xiàn)一定的協(xié)同殺傷活性作用(CDI<1)，且隨著吉非替尼濃度的增加或CIK細胞效靶比的提高，二者的協(xié)同殺傷活性作用呈現(xiàn)增高的趨勢。
　　 第四部分 CIK細胞輸注對腫瘤患者免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)
　　 4例患者共進行了6次CIK細胞體外擴增，擴增前外周血單個核細胞總數(shù)為1.2×109～1.6×10

16、9個，CD3+CD56+細胞的比率為2.1％～4.4％。經(jīng)抗人CD3單抗、IFN-γ和IL-2刺激，循環(huán)供氣密閉波浪式培養(yǎng)體系培養(yǎng)21天后，細胞總數(shù)達到1.0×1010～1.5×1010個，CD3+CD56+細胞的比率為14.7％～31.0％，CD3+CD56+細胞絕對數(shù)達到1.26×109～4.65×109個，CIK細胞回輸后無明顯的毒/副反應；患者在接受CIK細胞治療后外周血NK細胞比率逐漸增加、Treg細胞比率下降，在CIK細胞治

17、療后第2周、1月時與治療前相比，差異顯著，P<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、EGFR活性突變是NSCLC應用吉非替尼分子靶向治療發(fā)揮療效的核心影響因素，吸煙易合并p53突變，與誘導耐藥密切相關。
　　 2、擁有吉非替尼靶標合并p53突變的肺腺癌發(fā)生耐藥的機制，與選擇性獲得EGFR基因外顯子20 T790M突變細胞克隆有關，此克隆PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2通路持續(xù)活化，對親本細胞敏感劑量范圍內(nèi)的

18、吉非替尼無反應。
　　 3、CIK細胞對吉非替尼耐藥PC-9/GR細胞具有較強的殺傷活性；與吉非替尼具有協(xié)同作用，并具有一定程度逆轉(zhuǎn)耐藥的效應。
　　 4、CIK細胞過繼回輸能夠上調(diào)腫瘤患者體內(nèi)參與抗腫瘤天然免疫應答的、發(fā)揮細胞毒效應的NK細胞亞群，下調(diào)介導腫瘤免疫耐受的關鍵細胞因子和調(diào)節(jié)性T亞群，是一種具有臨床應用價值的抗腫瘤個體化免疫調(diào)節(jié)模式。吉非替尼聯(lián)合CIK細胞過繼性回輸可能為我國特色性EGFR基因突變NSCLC