1、目的:應(yīng)用酵母雙雜交法檢測(cè)人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E6蛋白與hDaxx的相互作用，并初步探討其相互作用對(duì)凋亡的影響，為進(jìn)一步研究E6蛋白在HPV16致癌機(jī)制中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: ⑴ pGADT7/E6重組體的構(gòu)建：采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增HPV16 E6基因。用EcoRI和BamHI分別雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pGAD

2、T7，純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及序列分析。 ⑵ pGBKT7/hDaxx重組體的構(gòu)建：用EcoRI和SalI分別雙酶切pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7，分別純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選到陽性克隆后，對(duì)重組質(zhì)粒行酶切鑒定。 ⑶酵母雙雜交檢測(cè)E6蛋白與hDaxx的相互作用：分4組共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，A組為 p

3、GADT7和pGBKT7，B組為pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx，C組為pGADT7/T和pGBKT7/Lam，D組為pGADT7/T和pGBKT7/p53。將轉(zhuǎn)化菌分別接種于SD/-Trp-Leu（二缺陷）固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～4d，待平板上長出單個(gè)菌落后，再將該菌落接種于SD/-Trp-Leu-His（三缺陷）和SD/-Trp-Leu-His-Ade（四缺陷）平板，30℃培養(yǎng)2～4d，觀察酵母菌的生長情況。裂解B組四

4、缺陷平板上的酵母菌，提取蛋白質(zhì)，經(jīng)Western blot檢測(cè)E6蛋白和hDaxx在酵母菌中的表達(dá)。 ⑷流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡：分別將0μg、10μg、20μg、30μg的pcDNA3.1(-)/hDaxx和10μg pcDAN3.1(-)/E6瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，以pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細(xì)胞組作為對(duì)照。5-FU處理36h后分別收集各組細(xì)胞，經(jīng)75％的乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。用統(tǒng)

5、計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 結(jié)果: ⑴ pGADT7/E6重組體的構(gòu)建：重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測(cè)序分析，所克隆的目的片段與GenBank上公布的HPV16 E6基因(Pubmed NC_001526)序列一致。 ⑵ pGBKT7/hDaxx重組體的構(gòu)建：重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到了與預(yù)期大小一致的約2.2kb的條帶。 ⑶ E6蛋白和hDaxx相互作用的檢測(cè)：4個(gè)組的二缺陷平板上均可長出白色菌落，但接

6、種到三缺陷和四缺陷平板后，只有B組、D組轉(zhuǎn)化菌可以生長，A組、C組未見菌落生長。提取B組四缺陷平板上的酵母蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)到E6蛋白和hDaxx的表達(dá)。 ⑷凋亡率的檢測(cè)：各組Hela細(xì)胞經(jīng)5-FU處理后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得，pcDAN3.1(-)/E6 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細(xì)胞組，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/E6和pcDNA3.1(-)

7、/hDaxx的Hela細(xì)胞，隨pcDNA3.1(-)/hDaxx轉(zhuǎn)染量的增加，凋亡率有所上升。 結(jié)論: ⑴成功地構(gòu)建了pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx酵母菌真核表達(dá)載體，并可在酵母菌AH109中表達(dá)。 ⑵ HPV16 E6與hDaxx在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。 ⑶ HPV16 E6蛋白可抑制5-FU誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡；在表達(dá)E6蛋白的Hela細(xì)胞中，hDaxx的過高表達(dá)促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的凋