1、霍山石斛是我國歷代本草記載的傳統(tǒng)名貴中草藥，多糖是其主要活性成分，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗白內(nèi)障等多種重要藥理活性。本課題旨在研究基于硫酸化修飾的抗蛋白質(zhì)非酶糖基化活性霍山石斛多糖的構(gòu)效關(guān)系。主要內(nèi)容如下：
　?。?）霍山石斛多糖純化及結(jié)構(gòu)鑒定：以霍山石斛類原球莖為實驗材料，水提醇沉法提取總多糖，經(jīng)分離純化獲得兩種相對均一組分DHP-D1、DHP-D2。采用高效液相測得DHP-D1、DHP-D2的相對分子量分別為3.2×103Da

2、、8.09×106Da。DHP-D1主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，摩爾比為1.023:0.023:0.021，同時還存在極少量的甘露糖和木糖；DHP-D1主鏈主要由1,4-α-D-Glcp、1,5-α-L-Araf、1,6-α-D-Glcp和1,6-α-D-Glap構(gòu)成，其中部分1,4-α-D-Glcp的C-6位上連接有1-α-Glcp及微量的1-β-D-Xylp，此外還存在微量的1,3-α-D-Manp，其的C-6位上連接有1-

3、α-Glcp。DHP-D2主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖組成，其摩爾比為0.896:0.723:0.2:0.072:0.031:0.028，其主鏈主要由1,6-β-D-Galp、1,4-β-D-Glcp、1,6-β-D-Glcp、1,5-α-L-Araf和1,6-α-D-Glcp組成，其中1,6-β-D-Galp的C-3位連接有少量的1-α-D-Manp、1-α-D-Xlyp、3-α-L-Rhap。
　　（2

4、）DHP-D1、DHP-D2的硫酸化修飾：選用氯磺酸-吡啶法對霍山石斛多糖進(jìn)行硫酸化修飾。采用單因素實驗，研究了溶劑及其用量，酯化試劑比例及其用量，反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度對硫酸化霍山石斛多糖取代度的影響。在此基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法優(yōu)化了霍山石斛多糖硫酸化的反應(yīng)條件。在100mg霍山石斛多糖、5mL有機溶劑甲酰胺、6mL酯化試劑、吡啶-氯磺酸體積比為2:1、反應(yīng)時間為160min、反應(yīng)溫度為60℃的反應(yīng)體系下，獲得取代度最大為1.473的霍山石

5、斛多糖硫酸化衍生物。分別以DHP-D1、DHP-D2為起始分子，通過改變反應(yīng)時間，制備了一系列不同取代度的霍山石斛多糖硫酸化衍生物。研究表明，DHP-D1硫酸化衍生物的取代度隨著時間延長而增加，但反應(yīng)時間過長不利于DHP-D2的硫酸化反應(yīng)。采用定位保護(hù)羥基的反應(yīng)策略，制備了定位硫酸化霍山石斛多糖衍生物，發(fā)現(xiàn)6位伯羥基較活潑易被硫酸根取代，能獲得較高取代度的霍山石斛多糖硫酸化衍生物。
　?。?）抗蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)：以體外蛋白質(zhì)非

6、酶糖基化反應(yīng)體系為實驗?zāi)Ｐ停园被覟殛栃詫φ?，對霍山石斛多糖DHP-D1、DHP-D2及其硫酸化衍生物的抗蛋白質(zhì)非酶糖基化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，氨基胍、霍山石斛多糖DHP-D1、DHP-D2及其硫酸化衍生物對蛋白質(zhì)非酶糖基化的抑制作用均存在劑量依賴關(guān)系。在培養(yǎng)的前21天，DHP-D1、DHP-D2及其硫酸化衍生物和氨基胍對蛋白質(zhì)非酶糖基化初期產(chǎn)物Amadori的抑制率呈上升趨勢，隨后下降至不同水平?；羯绞嗵羌捌淞蛩峄苌飳

7、madori產(chǎn)物的抑制活性高于氨基胍。霍山石斛多糖DHP-D1、DHP-D2及其硫酸化衍生物、氨基胍對蛋白質(zhì)非酶糖基化中期產(chǎn)物二羰基化合物和末期產(chǎn)物AGEs形成的抑制作用均存在劑量依賴關(guān)系，在培養(yǎng)的第28天抑制率最大。
　　（4）霍山石斛多糖抗蛋白質(zhì)非酶糖基化活性的構(gòu)效關(guān)系：研究表明，硫酸化修飾可提高霍山石斛多糖DHP-D1、DHP-D2對蛋白質(zhì)非酶糖基化的抑制作用，其抑制活性的高低與取代度的大小呈一定的正相關(guān)關(guān)系，并且6-O-硫