1、研究背景和目的:原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC;簡(jiǎn)稱肝癌），在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率排在第六位，每年全世界的發(fā)病是62.6萬(wàn)，我國(guó)每年死于肝癌約11萬(wàn)人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。相對(duì)于高死亡率，早期肝癌的發(fā)現(xiàn)比例卻非常低。近年來(lái)，雖然針對(duì)肝癌的治療手段不斷更新（包括手術(shù)切除、肝移植術(shù)、放射治療、介入治療、微創(chuàng)消融治療等），但肝癌治療的總體療效并無(wú)明顯提高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響肝癌預(yù)后的最主要因素。因此，加強(qiáng)對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究，挖掘有

2、意義的肝癌轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物，尋找新的防治靶點(diǎn)，是目前肝癌研究熱點(diǎn)之一。
　　 HMGB1屬于HMG（HMG）的亞家族成員，于20世紀(jì)70年代在小牛胸腺中發(fā)現(xiàn)，是一種含量豐富的核蛋白，分子質(zhì)量約30kD，存在于所有真核生物中。人的HMGB1基因定位于染色體13q12，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼含215個(gè)氨基酸的蛋白。HMGB1高度保守，人與嚙齒類動(dòng)物氨基酸序列同源性高達(dá)99％以上，而小鼠與大鼠氨基酸序列完全一致。
　　

3、 HMGB1因其細(xì)胞定位不同而發(fā)揮不同的功能和生物學(xué)效應(yīng)。目前研究認(rèn)為，除作為“晚期炎癥介質(zhì)”啟動(dòng)炎癥反應(yīng)外，分泌到細(xì)胞外的HMGB1還可能與腫瘤的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在增殖的細(xì)胞組織及分化活躍的細(xì)胞中，HMGB1基因表達(dá)有輕度的升高，而在乳腺癌、黑色素瘤、胃腸間質(zhì)細(xì)胞瘤、胰腺癌等腫瘤組織中，HMGB1的表達(dá)水平明顯高于其相對(duì)應(yīng)的正常組織，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。因此，認(rèn)為HMGB1也參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)

4、過(guò)程。Brezniceanu等在人原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了HMGB1蛋白的高水平表達(dá)，HMGB1可以阻斷Bcl-2家族促凋亡基因Bak誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其高水平表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1過(guò)表達(dá)與鼻咽癌的TNM分期和臨床分期密切相關(guān)，表達(dá)水平越高的患者，總體生存率和無(wú)瘤生存率越低;抑制HMGB1表達(dá)，鼻咽癌細(xì)胞的侵襲性減小。Volp等[15]在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)HMGB1及其受體RAGE共表達(dá)增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞的

5、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。應(yīng)用HMGB1反義寡核苷酸能顯著抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞信號(hào)通路上相關(guān)分子的表達(dá)[16]。在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌中，HMGB1可通過(guò)誘導(dǎo)其黑色素瘤抑制蛋白(MIA)的表達(dá)而有促進(jìn)其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及新生淋巴管生成的作用[17]。上述研究表明，HMGB1是多種腫瘤的促癌基因和促進(jìn)轉(zhuǎn)移基因。
　　 本研究擬應(yīng)用48例癌組織和癌旁組織組成的96點(diǎn)組織芯片，采用免疫組化方法檢測(cè)和觀察人體惡性腫瘤組織和正常組

6、織HMGB1表達(dá)情況;應(yīng)用Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)7種人肝癌細(xì)胞株和1種人正常肝細(xì)胞株HMGB1基因/蛋白的表達(dá);收集208例帶有5年完整隨訪資料的肝癌組織，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)分析HMGB1蛋白在肝癌中的表達(dá)及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，同時(shí)結(jié)合臨床隨訪資料回顧性分析HMGB1蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系;利用基因沉默及過(guò)表達(dá)技術(shù)初步研究HMGB1基因在肝癌增殖、遷移及侵襲中的作用，探討HM

7、GB1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用;為肝癌患者的診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)、綜合治療方案設(shè)計(jì)提供的理論依據(jù)。
　　 方法
　　 1、組織芯片技術(shù)分析HMGB1蛋白在人體正常組織和惡性腫瘤組織中的表達(dá)購(gòu)買西安愛(ài)麗娜生物科技公司的組織芯片，由48例癌組織和48例癌旁組織組成的96點(diǎn)組織芯片，包括胃、淋巴結(jié)、結(jié)腸、直腸、肝、肺、腎、食管、乳腺、宮頸、卵巢、膀胱、皮膚、腦、前列腺、胰腺等16種器官的癌及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織。免疫組化方法檢測(cè)HMGB

8、1蛋白在人體正常組織和常見(jiàn)惡性腫瘤組織的分布和表達(dá)。
　　 2、HMGB1基因/蛋白在人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)HepG2，HCCLM6（簡(jiǎn)稱M6），Huh7，MHCC97H（簡(jiǎn)稱97H），MHCC97L（簡(jiǎn)稱97L），HCCLM3（簡(jiǎn)稱M3），BEL-7404等7種肝癌細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞株L02的HMGB1基因/蛋白的表達(dá)情況。
　　 3、

9、HMGB1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義應(yīng)用免疫組化EnVisionTM二步法檢測(cè)HMGB1蛋白在208例肝癌組織中的表達(dá);應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用x2檢驗(yàn)分析HMGB1蛋白表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;采用Kaplan-Meier法回顧性分析HMGB1蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系;以COX回歸對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 4、HMGB1基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特

10、性的影響利用購(gòu)買自上海吉瑪公司的含有HMGB1基因干擾片段的siRNA，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染高表達(dá)HMGB1的97H肝癌細(xì)胞，用含空載體的病毒做對(duì)照。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)HMGB1干擾效率。利用cck-8檢測(cè)HMGB1基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖的影響;應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞體外遷移能力的影響;應(yīng)用鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞體

11、外侵襲能力的影響。
　　 5、HMGB1基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響應(yīng)用購(gòu)買自上海吉?jiǎng)P生物公司的含有HMGB1基因片段的GV142載體轉(zhuǎn)染低表達(dá)HMGB1基因的M3肝癌細(xì)胞，用含空載體的病毒做對(duì)照。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)HMGB1干擾效率。利用cck-8檢測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖的影響;應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響;應(yīng)用鋪

12、基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、組織芯片技術(shù)分析HMGB1蛋白在人體正常組織和惡性腫瘤組織中的表達(dá)惡性腫瘤組織中HMGB1陽(yáng)性率達(dá)89.6％，正常組織陽(yáng)性率77.1％，癌組織強(qiáng)陽(yáng)性率54.1％，癌旁正常組織強(qiáng)陽(yáng)性率6.5％。惡性腫瘤組織與癌旁正常組織HMGB1表達(dá)差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。癌組織中強(qiáng)表達(dá)例數(shù)占大多數(shù)，而正常組織多為弱至中

13、等強(qiáng)度表達(dá)。
　　 2、HMGB1基因/蛋白在肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)7種人肝癌細(xì)胞株和1種人正常肝細(xì)胞株中HMGB1基因的表達(dá)情況。在HMGB1在6種肝癌細(xì)胞:HepG2，M6，Huh7，97H，97L, BEL-7404表達(dá)水平均高于正常肝細(xì)胞中的表達(dá)水平，而肝癌細(xì)胞M3表達(dá)量低于正常肝細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的HMGB1

14、基因RNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，HMGB1蛋白在正常肝細(xì)胞株中陰性～弱表達(dá)，而在肝癌細(xì)胞株中均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　 3、HMGB1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示:HMGB1蛋白在208例肝癌組織中的高表達(dá)為134例(64.4％)，低表達(dá)為74例(35.6％)。HMGB1在肝癌的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，但在肝的正常組織呈陰性～低表達(dá)，在肝硬化組織呈低～中度表達(dá);HMGB1蛋白表達(dá)水平除

15、了與AFP(P=0.03＜0.05)明顯相關(guān); HMGB1蛋白表達(dá)和各臨床病理參數(shù)與肝癌患者生存期的單因素分析，結(jié)果顯示HMGB1蛋白高表達(dá)、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清AFP值是影響肝癌患者生存時(shí)間的因素(P值分別為:0.002、0.002、0.021、0.001、0.003、0.001);HMGB1蛋白表達(dá)、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血清AFP值與肝癌患者生存期的多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達(dá)、性別、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清A

16、FP值分別是影響肝癌生存預(yù)后的獨(dú)立因素(P值分別為:0.003、0.002、0.016、0.013、0.001)。
　　 4、HMGB1基因表達(dá)沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響①應(yīng)用含有HMGB1干擾片段的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)HMGB1較高的肝癌細(xì)胞M6。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各干擾片段HMGB1的表達(dá)情況，篩選干擾效率最高的片段為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象（命名為M6/S2細(xì)胞）。
　　

17、 ②應(yīng)用cck-8檢測(cè)HMGB1基因表達(dá)沉默后細(xì)胞的體外增殖情況，與M6細(xì)胞和M6/Mock細(xì)胞相比，M6/S2細(xì)胞的增殖速度明顯減慢。綜合結(jié)果表明HMGB1基因沉默后，腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)被抑制。
　　 ③應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因表達(dá)沉默后細(xì)胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示:與M6細(xì)胞和M6/Mock細(xì)胞相比，M6/S2細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P＜0.05)，說(shuō)明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌細(xì)胞的遷移

18、能力。
　　 ④應(yīng)用鋪了基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因表達(dá)沉默后細(xì)胞侵能力的改變，結(jié)果顯示:與M6細(xì)胞和M6/Mock細(xì)胞相比，M6/HMGB1-細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(P＜0.05)，說(shuō)明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 5、HMGB1基因表達(dá)增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響①應(yīng)用含有HMGB1基因片段的GV142載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)HMGB1較低的肝癌細(xì)胞M3，利用實(shí)時(shí)熒光定量P

19、CR和Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了HMGB1的M3細(xì)胞(命名為M3/HMGB1+)表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染空載體GV142為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象（命名為M3/Mock細(xì)胞）。
　　 ②應(yīng)用cck-8檢測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的體外增殖情況，與M3細(xì)胞和M3/Mock細(xì)胞相比，M3/HMGB1+細(xì)胞的增殖速度明顯增強(qiáng)。綜合分析HMGB1基因過(guò)表達(dá)后，能促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖。
　　 ③應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢

20、測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示:與M3細(xì)胞和M3/Mock細(xì)胞相比，M3/HMGB1+細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，說(shuō)明HMGB1基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的遷移能力。
　　 ④應(yīng)用鋪了基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)HMGB1基因過(guò)表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果顯示:與M3細(xì)胞和M3/Mock細(xì)胞相比，M3/HMGB1+細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，說(shuō)明HMGB1基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了肝

21、癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)論
　　 1.HMGB1在多種惡性腫瘤組織強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在正常組織呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度表達(dá)，我們認(rèn)為其可能成為鑒別正常組織與癌組織的的生物學(xué)標(biāo)志之一。
　　 2.HMGB1基因/蛋白在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常人肝細(xì)胞，表明HMGB1可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的分子之一。
　　 3.HMGB1蛋白在208例肝癌標(biāo)本中呈高表達(dá)，結(jié)合臨床隨訪資料分析表明HMGB1與患者的AFP值

22、密切相關(guān)，HMGB1蛋白高表達(dá)者的生存期明顯短于低表達(dá)者，提示HMGB1可作為肝癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo);
　　 4.HMGB1蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，在肝硬化組織中弱表達(dá)，而在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，提示HMGB1可作為臨床肝癌檢測(cè)的重要腫瘤標(biāo)志物;統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達(dá)、性別、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清AFP值分別是影響肝癌生存預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　 5.HMGB1基因與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲