1、目的： 苯甲酸鈉(sodium benzoate，SB)，即苯甲酸的鈉鹽，是目前我國(guó)乃至全世界普遍采用的食品和飲料防腐劑之一，近年來(lái)的研究對(duì)其生物安全性不斷提出了新的質(zhì)疑。而SB的神經(jīng)毒性尤其是對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元的毒性目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本課題以斑馬魚(yú)為活體模型，觀察SB對(duì)多巴胺能神經(jīng)元早期發(fā)育的影響及相關(guān)的行為學(xué)變化；并以大鼠PC12腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞作為體外模型，觀察SB對(duì)哺乳動(dòng)物多巴胺能神經(jīng)元的損傷以及在此條件下細(xì)胞MA

2、PK信號(hào)通路活化表達(dá)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步了解SB的神經(jīng)毒性及相關(guān)的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.成年斑馬魚(yú)的繁殖飼養(yǎng)及受精卵的生產(chǎn)、孵化：成年斑馬魚(yú)按照標(biāo)準(zhǔn)程序飼養(yǎng)，水溫在28.5℃，光照/黑暗周期(h)14：10；斑馬魚(yú)胚胎通過(guò)自然交配獲得，并在28.5℃的卵水中進(jìn)行孵化； 2.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)SB對(duì)2hpf胚胎的發(fā)育毒性影響：將胚胎暴露于不同濃度的SB(0～800μg/ml)并持續(xù)不同的暴露時(shí)間，每隔

3、24h統(tǒng)計(jì)生存率及畸形發(fā)生情況； 3.通過(guò)整體原位雜交檢測(cè)TH和DAT mRNA在3dpf斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)，以及利用整體免疫熒光檢測(cè)TH蛋白在3dpf斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)，來(lái)比較SB和MPTP對(duì)斑馬魚(yú)間腦腹側(cè)DA能神經(jīng)元的損傷作用； 4.通過(guò)行為學(xué)檢測(cè)觀察SB對(duì)6dpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)能力的影響； 5.大鼠PC12腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代，及生物學(xué)特性研究：PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中

4、，至90％融合時(shí)用胰酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為(3～5)×105/ml傳代；分別計(jì)數(shù)培養(yǎng)0～8d的細(xì)胞數(shù)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間； 6.利用免疫熒光法檢測(cè)PC12細(xì)胞中NF200及TH的表達(dá)； 7.饑餓同步化處理后的第3～4代細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察SB對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)育的影響；用MTT法檢測(cè)SB對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響；通過(guò)Western blot的方法觀察不同濃度(10～50mM) SB作用對(duì)PC12細(xì)

5、胞TH表達(dá)水平的影響；進(jìn)一步用DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)SB可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，并比較不同濃度(10～50mM) SB所致PC12細(xì)胞凋亡率的差異； 8.用Western blot方法檢測(cè)不同濃度(10～50mM) SB作用于PC12細(xì)胞24h后，JNK和ERK磷酸化水平的變化；以及40mM SB作用于PC12細(xì)胞(0～24h)后，JNK和ERK磷酸化水平的變化； 9.用Western blot方法檢測(cè)JNK的

6、特異性抑制劑SP600125預(yù)處理30min，再加入SB分別作用1h和3h后，JNK和ERK磷酸化水平的變化。 結(jié)果： 1.建立了適合本實(shí)驗(yàn)室條件的斑馬魚(yú)繁育系統(tǒng)，并能順利獲得滿足下游實(shí)驗(yàn)要求的高質(zhì)量的受精卵； 2.在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，低濃度SB(40μg/ml)處理后未見(jiàn)明顯降低胚胎的生存率(P>0.05)；然而，隨著SB暴露持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)以及濃度的增加(從100到800μg/ml)，生存率明顯降低；

7、 3.SB暴露能夠引起心包浮腫、卵黃囊再吸收遲緩、卵黃囊水腫、體長(zhǎng)縮短、脊柱彎曲等明顯的畸形改變；同時(shí)，胚胎的畸形率隨著SB濃度的增加而增加； 4.斑馬魚(yú)胚胎暴露于不同濃度的SB(40和100μg/ml)至3dpf能夠明顯下調(diào)TH基因在腹側(cè)間腦神經(jīng)元中的表達(dá)(對(duì)照組100±7.2％比51.42±4.1％和36.78±4.59％，分別以40和100μg/ml SB處理；P<0.001，與對(duì)照組相比)；與40μg/ml SB處

8、理組相比，100μg/ml組的作用明顯更為劇烈(P<0.001)；在陽(yáng)性對(duì)照組中，MPTP(45μg/ml)能夠明顯下調(diào)TH基因在腹側(cè)間腦神經(jīng)元的表達(dá)(P<0.001，與對(duì)照組相比)；與TH的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式一致，在免疫熒光檢測(cè)中SB同樣使TH蛋白在間腦神經(jīng)元中的表達(dá)明顯降低； 5.與觀察到的SB誘導(dǎo)TH表達(dá)下調(diào)一致的是，SB同樣能夠誘導(dǎo)腹側(cè)間腦神經(jīng)元中DAT的表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)(對(duì)照組100±8.8％比56.44±8.8％、41.1

9、3±3.9％、48.83±7.3％，分別對(duì)應(yīng)于40μg/ml SB、100μg/ml SB，和45μg/ml MPTP處理；P<0.001，與對(duì)照組相比)；并且SB100μg/ml的下調(diào)作用比40μg/ml組要更為嚴(yán)重(P=0.002)； 6.SB的暴露處理引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)能力的明顯降低(P<0.001，與對(duì)照組相比)；且在相同濃度SB暴露狀態(tài)下，SB的早期暴露要比晚期暴露的作用影響更為明顯(P<0.001)； 7.普

10、通培養(yǎng)條件下的PC12細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，胞體較小，胞核大，圓形，多為單核，偶可見(jiàn)雙核或核分裂相，核漿比大，有較多突起；體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(24.71±0.59)h；免疫熒光顯示，PC12細(xì)胞NF200和TH的表達(dá)均為陽(yáng)性； 8.SB可呈時(shí)間和濃度依賴性降低細(xì)胞活性；其中40mM SB作用24h后對(duì)PC12細(xì)胞的活性抑制率為47.81±5.23％； 9.低濃度(10mM)的SB可增強(qiáng)PC12細(xì)胞中TH的表達(dá)，

11、而高濃度(40～50mM)的SB則可降低TH的表達(dá)；同時(shí)，SB可呈時(shí)間依賴性降低TH的表達(dá)； 10.SB可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞核形態(tài)呈凋亡改變；進(jìn)一步利用FACS檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡所形成的亞二倍體凋亡峰，其峰值隨SB濃度的增加而增加； 11.SB以濃度依賴性增加PC12細(xì)胞JNK的磷酸化水平，同時(shí)以濃度依賴性方式降低細(xì)胞中ERK的磷酸化水平； 12.40mM SB作用(0～24h)，1h時(shí)即引起JNK的磷酸化，3h

12、達(dá)到高峰，6h時(shí)雖略有下降，但仍明顯高于對(duì)照組，隨后的時(shí)間里又持續(xù)高表達(dá)；而同樣處理?xiàng)l件下，ERK的磷酸化水平在6h時(shí)突然降低，此后的時(shí)間里雖稍有增加，但仍低于對(duì)照組水平； 13.JNK抑制劑SP600125的預(yù)處理，在SB作用1h時(shí)能明顯降低SB所致的JNK的磷酸化水平增加；但到3h時(shí)，SP600125對(duì)JNK的激活抑制作用已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；不過(guò)，SP6000125的預(yù)處理，短時(shí)間內(nèi)(3h)對(duì)SB作用下的PC12

13、細(xì)胞ERK的磷酸化無(wú)明顯影響。 結(jié)論： 1.SB的暴露處理導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎的生存率以時(shí)間和濃度依賴性的方式明顯降低，同時(shí)畸形率呈濃度依賴性增加； 2.SB能夠誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎間腦DA能神經(jīng)元TH和DAT的表達(dá)明顯下調(diào)；并且這種DA能神經(jīng)元基因的表達(dá)下調(diào)呈濃度依賴性； 3.SB的暴露處理會(huì)引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)能力的明顯下降，并且這種下降與暴露時(shí)期相關(guān)； 4.SB能夠抑制PC12細(xì)胞的增殖，影響多巴胺的合成