1、研究背景：肝細(xì)胞肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的腫瘤之一，隨著治療方法和影像技術(shù)水平的提高，早期肝癌切除術(shù)后的五年生存率已達(dá)50％-75％，但肝癌伴有門靜脈癌栓預(yù)后很差，其中位生存期僅為2.7月，而肝癌無(wú)門靜脈癌栓患者的中位生存期達(dá)24.4個(gè)月。肝細(xì)胞肝癌容易侵犯肝內(nèi)血管特別是門靜脈，癌栓易于在主瘤附近的門靜脈血管內(nèi)形成，約有30％-60％的肝癌病人常常伴有門靜脈癌栓。門靜脈癌栓的特征迫切需要我們了解其發(fā)生的分子機(jī)制，找到治療肝癌伴門靜脈新的的方法，

2、發(fā)現(xiàn)門靜脈癌栓分子學(xué)標(biāo)記物，從而為臨床治療提高新的靶點(diǎn)。 肝癌的發(fā)生發(fā)展是由多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程。盡管所有的細(xì)胞都擁有同樣的基因組，但在不同的細(xì)胞內(nèi)會(huì)有不同的基因處在活躍狀態(tài)，從而合成不同的蛋白質(zhì)。同樣，不同細(xì)胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白質(zhì)的不同來(lái)決定的，因而需要在整體水平上分析肝癌細(xì)胞內(nèi)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，以雙向電泳、質(zhì)譜分析為主的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和手段為腫瘤研究提供了良好的技

3、術(shù)平臺(tái)，蛋白質(zhì)組研究直接定位于蛋白質(zhì)水平，從整體、動(dòng)態(tài)、定量的角度去研究腫瘤發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。不僅有助于進(jìn)一步揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制，亦有助于發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行早期臨床診斷的腫瘤標(biāo)記物(biomarker)。 本研究通過(guò)雙向電泳的方法研究肝癌原發(fā)灶與門靜脈癌栓之間蛋白表達(dá)的差異，探討這些差異蛋白在肝癌門靜脈轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。從而尋找到作為門靜脈癌栓形成的標(biāo)記物和治療門靜脈癌栓新的靶點(diǎn)。 材料和方法：1.材料收集200

4、5年1月至2005年6月間東方肝膽外科醫(yī)院的肝癌伴門靜脈癌栓手術(shù)患者的手術(shù)標(biāo)本5例。 2.方法收集標(biāo)本都經(jīng)-80℃液氮凍存，組織經(jīng)研磨后加入裂解液，超聲裂解，高速離心(15000轉(zhuǎn)/分)1小時(shí)后收集上清液，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。雙向電泳：經(jīng)等一相電聚焦電泳(非線性pH3-10)和二相十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，用雙胺銀染法(分析膠)和考馬斯亮藍(lán)(制備膠)染色。掃描獲取圖象，用PDQuest

5、7.0軟件進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)和匹配分析。差異蛋白點(diǎn)切膠，膠上酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽，MALDI-TOF質(zhì)譜，軟件分析數(shù)據(jù)，鑒定出差異蛋白質(zhì)。Westernblot驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.原發(fā)灶和門靜脈癌栓標(biāo)本進(jìn)行2次2-DE以保證試驗(yàn)的重復(fù)性共獲得各組20塊2D膠圖譜，蛋白表達(dá)譜均類似，多集中分布于pI4-9間的區(qū)域。 2.用PDQuest7.0軟件將蛋白圖譜分成2個(gè)類別進(jìn)行點(diǎn)的鑒定.原發(fā)灶組平

6、均點(diǎn)數(shù)1350±78，癌栓組點(diǎn)數(shù)1230±53。 3.參考膠進(jìn)行兩組之間的匹配分析，篩選出在超過(guò)2例以上，灰度均存在2倍以上的差異點(diǎn)20個(gè)。 4.通過(guò)質(zhì)譜分析和NCBI數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果：包括膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinV)、分泌性外源性血凝結(jié)素1(Glactin1)、過(guò)氧化物還原酶1(peroxiredoxin1)、細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)、高遷移率族蛋白框1(HMBG1)等在內(nèi)的20個(gè)差異蛋白。 5.Wester