1、目的：乳腺癌是威脅女性健康的重大疾病。分子靶向治療是利用腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)，而正常細(xì)胞很少或不表達(dá)的特定基因或基因的表達(dá)產(chǎn)物，形成靶向，最大限度地殺傷腫瘤細(xì)胞。目前對(duì)ER、PR陽性和/或Her-2過度表達(dá)的乳腺癌患者術(shù)后的內(nèi)分泌治療和赫賽汀分子靶向治療取得了較好的效果。但對(duì)ER、PR、Her-2陰性表達(dá)的乳腺癌患者術(shù)后沒有相應(yīng)的令人滿意的靶向藥物治療。PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路是國際上近年來研究得出的對(duì)腫瘤生長調(diào)控的主要通路

2、之一，針對(duì)該通路的靶向藥物的研究是近年來研究的熱點(diǎn)。本研究主要研究PI3K/Akt/mTOR傳導(dǎo)通路在乳腺癌靶向治療中的應(yīng)用價(jià)值和聯(lián)合靶向治療的意義，為臨床中晚期乳腺癌患者的術(shù)后治療打下理論研究的基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、隨機(jī)選取我院臨床病理證實(shí)的乳腺癌患者66例臨床資料及病理切片，利用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素－過氧化物酶（SP）法檢測(cè)乳腺癌組織中PTEN和PPARγ蛋白的表達(dá)，調(diào)取66例乳腺癌患者臨床資料，分析

3、乳腺癌組織中PTEN和PPARγ蛋白表達(dá)與患者臨床分期、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、Her-2、ER、PR表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 2、將含有pcDNA3.0-PTEN真核表達(dá)質(zhì)粒的E coli JM109細(xì)胞用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增，參照UNIQ-10柱式質(zhì)粒抽提試劑盒操作步驟抽提質(zhì)粒，分離純化質(zhì)粒并電泳鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將獲得的pcDNA3.0-PTEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞株，傳代培養(yǎng)細(xì)胞株，West-Blot鑒定P

4、TEN蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 3、常規(guī)連續(xù)體外傳代培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞株。將MCF-7細(xì)胞按5.0×106/L的濃度接種96孔板，按析因試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組，①轉(zhuǎn)染組：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒1μg轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞；②聯(lián)合組：給予pcDNA3.0-PTEN轉(zhuǎn)染和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ天然激動(dòng)劑15d-PGJ2 40μmol/L；③干預(yù)組：15d-PGJ2 40μmol/L處理細(xì)胞；④對(duì)照

5、組：常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，不做任何處理。采用MTT法觀察15d-PGJ2和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。
　　 4、常規(guī)連續(xù)體外傳代培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長期生長良好的乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，按2.0×106細(xì)胞/孔接種24孔板，按照正交試驗(yàn)L8(27)正交表安排試驗(yàn)。
　　 5、常規(guī)連續(xù)體外傳代培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞株。在對(duì)數(shù)生長期消化細(xì)胞，制成細(xì)

6、胞懸液，按每孔接種3.0×105個(gè)細(xì)胞，總體積3ml，接種于6孔板。按照正交試驗(yàn)L8(27)正交表安排試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 6、用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，組間比較行方差分析。計(jì)數(shù)資料根據(jù)樣本理論頻數(shù)用Fisher確切概率法或χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)之間的相關(guān)性用交叉分類的2個(gè)因素，2水平表的相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（即：P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。用Excel表繪制細(xì)胞生長抑制曲線。
　　 結(jié)果

7、：
　　 1、PTEN和PPARγ蛋白在乳腺癌中總陽性率分別為68.2％、63.6％。PTEN陽性的乳腺癌切片中表達(dá)陽性部位主要在細(xì)胞核內(nèi)占72.86％，胞漿表達(dá)占27.14％。PPARγ蛋白陽性乳腺癌切片主要表達(dá)在核膜占87.3％。相關(guān)分析表明PTEN與PPARγ、ER、PR、HER-2陽性率無顯著相關(guān)（P均＞0.05）。PPARγ與ER、PR、Her-2陽性率無顯著相關(guān)（P均＞0.05）。在66例乳腺癌病理切片中PTEN陽性

8、乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為49.23％(288/585)，PTEN陰性乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為66.37％（231/348）。PPARγ陽性乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為54.41％(351/645)，PPARγ陰性乳腺癌患者淋巴結(jié)平均轉(zhuǎn)移率為58.33％(168/288)。PTEN和PPARγ蛋白表達(dá)雙陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為51.59%（243/471），PTEN和PPARγ蛋白表達(dá)雙陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為70.68%(123/174)。
　　

9、 2、實(shí)驗(yàn)得到的pcDNA3.0-PTEN真核表達(dá)質(zhì)粒大小約為6.0 kb，質(zhì)粒濃度為0.0803 μg/μl。該質(zhì)粒目的基因在COS-7細(xì)胞株表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)West-Blot鑒定證實(shí)為目的基因表達(dá)產(chǎn)物。
　　 3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞吸光度（A）值結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、15d-PGJ2干預(yù)均能有效地抑制MCF-7細(xì)胞生長。在48、72、96h時(shí)點(diǎn)，聯(lián)用組的效果較其他兩組的抑制作用更明顯（P<0.

10、05)。用A值計(jì)算細(xì)胞抑制率，對(duì)照組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)均未顯示出生長抑制；24h時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)染組、聯(lián)合組、干預(yù)組的細(xì)胞抑制率分別為2%、0%、0%；在48h時(shí)點(diǎn)分別為28%、39%、26%；在72h時(shí)點(diǎn)分別為74%、84%、70%；在96h時(shí)點(diǎn)分別為85%、89%、80%。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組對(duì)G0、G1期細(xì)胞的阻滯作用較強(qiáng)（P＜0.05），干預(yù)組作用較弱（P＜0.05）。聯(lián)合組的G0、G1期阻滯效應(yīng)較轉(zhuǎn)染組弱（P＜0.05

11、），但較干預(yù)組強(qiáng)（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組、干預(yù)組和聯(lián)合組均不能有效地誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡(P＜0.05）。聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率低于干預(yù)組(P＜0.05），轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率與聯(lián)合組、干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與15d-PGJ2 40μmol/L干預(yù)有交互作用，聯(lián)用組與其他兩組比較，細(xì)胞凋亡率下降(P＜0.05）。
　　 4、羅格列酮、5-氮雜-2

12、′-脫氧胞苷和雷帕霉素均能能有效的抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的生長，雷帕霉素的抑制率最大（P＜0.05）。聯(lián)合用藥能明顯增加細(xì)胞生長抑制率（P＜0.05）。雷帕霉素在中低濃度干預(yù)，MCF-7細(xì)胞凋亡率最大。增加濃度不增加凋亡。在中低濃度雷帕霉素與羅格列酮聯(lián)用不增加細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。雷帕霉素聯(lián)合5-Aza可增加細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。隨著濃度的增加，5-Aza干預(yù)使細(xì)胞G1比例逐漸下降，S期比例逐漸上升（P＜0.05）

13、。
　　 結(jié)論：
　　 1、在乳腺癌組織中PTEN和PPARγ的表達(dá)均有缺失或非正常表達(dá)。隨著臨床分期的進(jìn)展PTEN、PPARγ陽性率均下降，PTEN表達(dá)位置由正常細(xì)胞漿表達(dá)轉(zhuǎn)為細(xì)胞核表達(dá)。PPARγ由正常核膜表達(dá)轉(zhuǎn)為胞漿核膜表達(dá)。PTEN、PPARγ、ER、PR、Her-2的表達(dá)之間無顯著相關(guān)性。PTEN和PPARγ蛋白雙陰性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，雙陽性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低。
　　 2、pcDNA3.0

14、-PTEN真核表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)含有所需目的基因，該真核表達(dá)系統(tǒng)能在真核細(xì)胞株COS-7表達(dá)所需目的基因產(chǎn)物，可以應(yīng)用該質(zhì)粒對(duì)PTEN基因缺失或雜合性缺失的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)性治療。
　　 3、pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、15d-PGJ2干預(yù)均能有效地抑制體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞細(xì)胞株的生長。pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和15d-PGJ2聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞抑制率優(yōu)于獨(dú)立用藥，兩藥有交互作用。兩藥的可能作用機(jī)制為周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞分

15、化，而凋亡作用不明顯。pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與15d-PGJ2 40μmol/L干預(yù)有交互作用，兩者聯(lián)用細(xì)胞凋亡率下降。
　　 4、雷帕霉素、羅格列酮和5-氮雜-2′-脫氧胞苷三種藥物均能有效的抑制體外培養(yǎng)的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生長。雷帕霉素的抑制作用最為顯著。雷帕霉素抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的主要機(jī)制為誘導(dǎo)早期凋亡和抑制細(xì)胞有絲分裂。羅格列酮抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的主要機(jī)制為周期阻滯，能有效的將乳腺癌細(xì)胞阻滯于