1、研究背景： 下丘腦神經(jīng)垂體束(Hypothalamo-neurohypophysealtract)由下丘腦視上核和室旁核大細胞神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突形成，軸突遠端終止于垂體后葉，其功能主要是合成、轉(zhuǎn)運和釋放大細胞神經(jīng)元分泌的加壓素(argininevasopressin，AVP)和催產(chǎn)素(oxytocin，OT)。釋放入血的AVP和OT具有廣泛的作用，AVP可根據(jù)血漿滲透壓調(diào)節(jié)腎臟遠曲小管水的重吸收，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)水電解質(zhì)平衡。神經(jīng)

2、外科臨床中可常見因創(chuàng)傷、腫瘤及手術(shù)等原因造成下丘腦、垂體柄及垂體后葉損傷導致AVP合成或釋放不足，而產(chǎn)生中樞性尿崩癥(Centraldiabetesinsipidus，CDI)。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)(Hypothalamo-neurohypophysealsystem，HNS)損傷后，如垂體切除或垂體柄、下丘腦損傷，將出現(xiàn)典型的中樞性尿崩癥表現(xiàn)以及因為HNS的中斷或受損而導致下丘腦大細胞神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的逆行性退變，但其退變的

3、規(guī)律及神經(jīng)元死亡的確切機制尚未完全明了?；谝陨险J識和臨床上的考慮，我們進行了立體定向下大鼠垂體切除，并通過摸索建立了垂體壓迫模型，來研究HNS最末端離斷和壓迫狀態(tài)下中樞性尿崩癥的發(fā)生及其他生物學特性的改變，研究下丘腦視上核AVP神經(jīng)元存活及退變規(guī)律及其與中樞性尿崩癥發(fā)生的關(guān)系，并探討下丘腦視上核AVP神經(jīng)元逆行性退變死亡的凋亡機制。 研究目的： 1.比較立體定向與顯微外科咽旁入路垂體切除術(shù)的優(yōu)缺點以及建立大鼠垂體壓迫模

4、型 2.觀察垂體切除或垂體壓迫術(shù)后中樞性尿崩癥的發(fā)生及生物學特征的變化，并探討不同損傷方式間的差異 3.觀察垂體切除或壓迫后不同時期下丘腦視上核AVP神經(jīng)元退變和存活的時間變化規(guī)律，并分析其與中樞性尿崩癥的關(guān)系 4.應(yīng)用細胞凋亡的檢測方法來研究下丘腦視上核AVP神經(jīng)元逆行性退變死亡的凋亡機制 材料與方法： 第一部分：大鼠垂體切除或壓迫后尿崩及生物學特征觀察 1.動物模型的建立：立體定向下和

5、顯微外科咽旁入路行大鼠垂體切除，采用咽旁入路自體肌肉填塞垂體窩的方法建立大鼠垂體壓迫模型。 2.實驗動物分組：SD大鼠220只，隨機分為立體定向下去垂體組80只，咽旁入路顯微外科垂體切除組60只，咽旁入路垂體壓迫組40只，立體定向垂體切除和垂體壓迫兩種空手術(shù)組各20只，以空手術(shù)組作為對照組資料。 3.測定大鼠術(shù)后的生物學特征變化及觀察中樞性尿崩的發(fā)生：觀察動物的存活及垂體全切情況；術(shù)后每天測定體重、進食量、飲水量、尿量以

6、及尿比重。 4.血漿AVP含量測定：于術(shù)后第3、5、10、20、30天應(yīng)用放射免疫方法(RIA)測定立體定向垂體切除組、垂體壓迫組以及對照組的血漿AVP濃度。 5.垂體壓迫術(shù)后垂體窩體積的測定：于垂體壓迫術(shù)后30天解剖動物的垂體窩分別測量前后徑、左右徑和高度，并計算垂體窩體積。 6.術(shù)后鞍區(qū)解剖及切除的垂體組織染色：驗證垂體是否全切除。 7.數(shù)據(jù)處理：用SPSS10.0行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用-x±s表示，采

7、用卡方檢驗、單向方差分析、重復測量數(shù)據(jù)方差分析以及各時間點單獨效應(yīng)的比較(LSD方法)。以P＜0.05表示有顯著性差異。 第二部分垂體切除或壓迫后不同時期下丘腦AVP神經(jīng)元的存活情況 1.模型制備及分組：模型建立方法同第一部分。分組：SD大鼠48只，隨機分為立體定向垂體切除組16只，壓迫組16只，兩種空手組各8只，以空手術(shù)組作為對照組資料。 2.動物標本準備及免疫組化檢測：各組動物分別于術(shù)后3d、10d、20d、

8、30d用4％多聚甲醛灌注后取材，冰凍切片機下丘腦視上核、室旁核及正中隆起部位冠狀切片。視上核AVP免疫組化染色：切片涼干后，3％H2O2及山羊血清封閉，兔抗AVP一抗1：100，4℃過夜，對照組、垂體切除組用：熒光Cy3標記的羊抗兔IgG二抗1：200；垂體壓迫組用：熒光FITC標記的羊抗兔IgG二抗1：100染色。熒光顯微鏡下觀察、陽性神經(jīng)元計數(shù)并拍照。室旁核和正中隆起免疫組化染色步驟同上。 3.數(shù)據(jù)處理：用SPSS10.0行

9、統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用-x±s表示，采用單向方差分析以及多重比較，以P＜0.05為具有顯著性差異。 第三部分大鼠垂體切除或壓迫后下丘腦視上核AVP神經(jīng)元的凋亡表達 1.模型制備及分組：模型建立方法同第一部分。分組：SD大鼠48只，隨機分為垂體切除組16只，壓迫組16只，兩種空手組各8只，以空手術(shù)組作為對照組資料。 2.檢測Caspase-3的表達：各組動物分別于術(shù)后1d、5d、10d各取4只，4％多聚甲醛灌注后取材，

10、冰凍切片機下丘腦視上核部位冠狀切片。視上核AVP與Caspase-3免疫組化染色：兔抗大鼠Caspase-3(P20)一抗1：200；熒光FITC標記的羊抗兔IgG二抗1：100；兔抗AVP一抗1：100；熒光Cy3標記的羊抗兔IgG二抗1：200：熒光顯微鏡下觀察并拍照。 3.下丘腦視上核神經(jīng)元凋亡的透射電鏡觀察：各組2只動物于術(shù)后10d在日立-H7500TEM透射電鏡下觀察神經(jīng)元的凋亡情況。 4.凋亡DNA抽提及電泳

11、檢測(DNALadder檢測)：各組2只動物于術(shù)后10d行DNA抽提及電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)成像觀察。 結(jié)果： 1.立體定向下垂體切除組1月后存活(86.7％)要優(yōu)于顯微手術(shù)組(70.0％)，立體定向組手術(shù)時間和術(shù)后蘇醒時間均少于顯微外科組，而全切率顯微手術(shù)組要高于立體定向組。 2.垂體壓迫組術(shù)后垂體窩測定顯示高度和前后徑增加，體積增加35％，達到了垂體壓迫的目的。 3.垂體切除或壓迫后動物體重均出現(xiàn)

12、了明顯下降，切除組于術(shù)后2周后恢復，而壓迫組術(shù)后25天后才開始恢復。垂體切除和壓迫術(shù)后動物的每天進食量也出現(xiàn)了相應(yīng)變化，術(shù)后動物的進食量出現(xiàn)了明顯的下降，均在術(shù)后10內(nèi)降至谷底，而垂體壓迫組的進食量下降尤為明顯；15天以后進食量明顯增加，但垂體壓迫組仍一直不能恢復到正常水平。垂體切除或壓迫后動物飲水量和尿量均明顯增多，垂體切除組表現(xiàn)為術(shù)后3天內(nèi)飲水量、尿量顯著增多(3天內(nèi)79.2mL±15.7mL)，以后明顯減少(4～8天20.1mL±

13、3.8mL)，8天后再次增多：而壓迫組則為術(shù)后15d后才開始漸進性增多。尿比重也出現(xiàn)相應(yīng)的改變。 4.垂體切除或壓迫術(shù)后血漿AVP含量的改變，術(shù)后3天時，垂體切除組AVP含量顯著下降至(157.4±16.7)pg/mL，明顯低于對照組和壓迫組(P＜0.05)，5天時AVP含量較3天時增多(308.2±18.6)pg/mL，仍低于其他兩組(P＜0.05)，10天后再次減少。而垂體壓迫組在術(shù)后20天以后AVP含量呈現(xiàn)逐漸減少趨勢，低

14、于對照組但仍高于切除組。 5.垂體切除組術(shù)后3d出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量略有減少，約為對照組的93.2％；10d后神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，存活75.4％，20d后存活僅為31％，30d后為29％，達到了穩(wěn)定狀態(tài)。垂體壓迫組術(shù)后3d、10d較對照組神經(jīng)元分別增加了2.3％和2.1％，但無明顯統(tǒng)計學差異。術(shù)后20d時下降至對照組的77.4％，術(shù)后30d時進一步下降至32.5％。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)垂體切除或壓迫術(shù)后下丘腦視上核存活的AVP神經(jīng)元出現(xiàn)了明

15、顯的功能代償性表現(xiàn)：神經(jīng)元胞體增大，AVP染色增強等。 6.垂體切除或壓迫術(shù)后30d下丘腦室旁核AVP神經(jīng)元分別存活53.6％和61.2％。垂體切除或垂體壓迫術(shù)后正中隆起的AVP陽性神經(jīng)纖維的表達均明顯增強。 7.術(shù)后5d、10d時，垂體切除和垂體壓迫組動物下丘腦視上核均可見到明顯的Caspase-3(P20)的表達，垂體切除組更多。與AVP染色結(jié)合觀察發(fā)現(xiàn)Caspase-3的表達大部分在AVP陽性的細胞內(nèi)，但有少部分不

16、在AVP陽性細胞內(nèi)，考慮可能為OT神經(jīng)元。 8.下丘腦視上核透射電鏡觀察，垂體切除和垂體壓迫組均可見到處于不同凋亡階段的神經(jīng)元凋亡改變，早期神經(jīng)元核內(nèi)染色質(zhì)濃聚、邊集，晚期染色質(zhì)進一步積聚及形成凋亡小體，而細胞器仍保持完整。 9.垂體切除和垂體壓迫術(shù)后10d，下丘腦視上核DNA抽提電泳出現(xiàn)了明顯的“DNALadder”，表現(xiàn)為180bp-200bp的片段，呈梯狀排列。 結(jié)論： 1.兩種垂體切除的方法各有優(yōu)

17、缺點，應(yīng)根據(jù)研究目的和條件來選擇。通過咽旁入路自體肌肉填塞垂體窩成功地建立了大鼠的垂體壓迫模型。 2.垂體切除或壓迫后明顯改變了大鼠的生物學特征，并且出現(xiàn)了不同類型的中樞性尿崩癥。垂體切除后出現(xiàn)了明顯的三相性中樞性尿崩，而垂體壓迫后則表現(xiàn)為慢性漸進性尿崩癥。垂體切除和壓迫術(shù)后血漿AVP的含量也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。 3.垂體切除或壓迫后，下丘腦視上核AVP神經(jīng)元均出現(xiàn)了明顯的逆行性退變，具有不同的時間變化規(guī)律，并且與各自尿崩