1、研究背景： NB是兒童期最常見的顱外實(shí)體瘤，它不但惡性程度高、侵襲力強(qiáng)，而且早期轉(zhuǎn)移率高、晚期病例多、治療效果差。尤其是晚期高危病例，常因?qū)σ痪€藥物不敏感導(dǎo)致耐藥復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期生存率很低，是制約NB患兒生存率提高的主要原因。因此積極尋找有效的二線化療藥物是提高NB患兒生存率的重要手段。HCPT是我國(guó)利用天然資源優(yōu)勢(shì)研制出的純天然生物堿抗腫瘤藥，對(duì)多種腫瘤具有較好的療效，且毒副作用較低、價(jià)格低廉。但其在小兒NB的治療作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)

2、道。因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床治療來探討HCPT對(duì)NB的療效，為探索NB新的、有效的化療方案，提高生存率，提供理論基礎(chǔ)與臨床經(jīng)驗(yàn)。 第一部分羥基喜樹堿對(duì)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤SMS-KCNR細(xì)胞增殖的影響 目的： 研究HCPT在體外對(duì)人NB細(xì)胞系SMS-KCNR細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。 方法： 采用MTT法觀察不同濃度的HCPT(2.5～200nM)作用不同時(shí)間(24h、48h、72h)后對(duì)SMS-

3、KCNR細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)應(yīng)用平板集落形成試驗(yàn)觀察不同濃度的HCPT(2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、20nM)對(duì)SMS-KCNR細(xì)胞集落形成的影響。用不同濃度的HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細(xì)胞24h及48h，碘化丙錠(PI)染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞周期的改變。 結(jié)果： 1.HCPT能顯著抑制SMS-KCNR細(xì)胞增殖，并隨藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而抑制作

4、用增強(qiáng)，呈明顯濃度和時(shí)間依賴性。 2.在HCPT(2.5～200nM)作用24h及48h后SMS-KCNR細(xì)胞增殖抑制率分別為3.6～64.7％、12.5～91.7％，而2.5～20nM濃度范圍HCPT作用72h的抑制率為36.7～97％。 3.HCPT能明顯抑制SMS-KCNR細(xì)胞集落形成，濃度為10nM和20nM時(shí)能完全抑制其集落形成。 4.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、2

5、0nM)作用SMS-KCNR細(xì)胞24h，使細(xì)胞周期阻滯于S期；作用48h使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。 結(jié)論： HCPT能顯著抑制SMS-KCNR細(xì)胞增殖和集落形成，其抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。HCPT作用SMS-KCNR細(xì)胞24h及48h，分別使細(xì)胞周期阻滯于S期及G2/M期。 第二部分羥基喜樹堿對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SMS-KCNR細(xì)胞凋亡的影響 目的： 研究HCPT在體外對(duì)人NB細(xì)胞系SMS-KC

6、NR細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，證實(shí)HCPT對(duì)SMS-KCNR增殖抑制作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果。 方法： 用光學(xué)顯微鏡及DAPI染色熒光顯微鏡觀察HCPT作用48h后SMS-KCNR細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡形態(tài)學(xué)改變。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNALadder的形成。用流式細(xì)胞儀(AnnexinV和PI雙染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。采用Westernblot檢測(cè)不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、2

7、0nM)作用SMS-KCNR細(xì)胞48h后線粒體凋亡途徑中P53、Bcl-2、Bax、cytochromec、caspase-3及PARP蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細(xì)胞48h后能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性。 2.光學(xué)顯微鏡顯示不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細(xì)胞48h

8、后使細(xì)胞密度呈劑量依賴性降低。DAPI染色熒光顯微鏡下觀察到典型的凋亡小體形成。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到明顯的DNA梯形條帶(DNAladder)。 3.流式細(xì)胞儀(AnnexinV和PI雙染法)檢測(cè)顯示HCPT作用SMS-KCNR細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增加。在2.5～20nM的HCPT作用48h后，早期凋亡細(xì)胞分別為12.22～50.78％，晚期凋亡細(xì)胞分別為8.67～67.32％，總凋亡細(xì)胞分別為20.89～97.6

9、6％，明顯高于對(duì)照組(分別為4.15％、0.13％、4.28％)。 4.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細(xì)胞48h后，隨作用濃度的增加，P53表達(dá)逐漸增高，呈顯著的濃度依賴性。 5.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細(xì)胞48h后，Bcl-2、Bax表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值未見改變。 6.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細(xì)胞48h后，隨作用濃度的增加，胞質(zhì)

10、cytochromec表達(dá)逐漸增高，線粒體cytochromec表達(dá)逐漸降低，呈顯著的濃度依賴性。 7.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細(xì)胞48h后，caspase-3被激活，procaspase-3表達(dá)逐漸減少，有活性的17kDa亞基表達(dá)逐漸增加，呈顯著的濃度依賴性。 8.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細(xì)胞48h后，PARP被激活，89kDa的裂解片段表達(dá)逐漸增加，呈顯著的濃度依賴

11、性。 結(jié)論： HCPT能誘導(dǎo)SMS-KCNR細(xì)胞凋亡，凋亡的誘導(dǎo)作用呈顯著劑量依賴性。HCPT通過P53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)cytochromec釋放，并最終通過激活caspase-3及PARP促使細(xì)胞凋亡。HCPT有臨床應(yīng)用治療NB的可行性。 第三部分羥基喜樹堿治療復(fù)發(fā)和難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤的療效觀察 目的： 復(fù)發(fā)和難治性NB療效差，生存時(shí)間短，死亡率高。HCPT是純天然生物堿抗腫瘤藥，對(duì)多

12、種腫瘤有較好療效，但它在NB的治療作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本部分在體外預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用HCPT治療復(fù)發(fā)和難治性NB，探討其療效。 方法： 10例復(fù)發(fā)和2例難治性NB患兒接受HCPT化療，其中5例復(fù)發(fā)患兒接受HCPT單藥治療，余7例患兒接受HCPT聯(lián)合治療。HCPT單藥治療用法：7.5mg/m2，靜脈滴注，d1～14；HCPT聯(lián)合化療采用改良新A1與改良B方案交替應(yīng)用。改良新A1方案：CTX1200mg/m2d1、VP16

13、100mg/m2d1～5、HCPT5mg/m2d1～3、CDDP90mg/m2d4；改良B方案：IFO1.5g/m2d1～5、HCPTSmg/m2d1～3、CBP450mg/m2d2，均采用靜脈滴注。 結(jié)果： 部分緩解4例(33.3％)，疾病穩(wěn)定8例(66.7％)。有效患者中位緩解時(shí)間3.5(2～5)個(gè)月。HCPT單藥治療不良反應(yīng)輕微，HCPT聯(lián)合化療的主要不良反應(yīng)為骨髓抑制及消化道反應(yīng)，無化療相關(guān)的死亡。 結(jié)論