1、本研究選用質粒pGAPZαA作為載體構建含目的基因的重組表達質粒pGAPZαA-CMTI Ⅰ,并通過PCR、酶切鑒定以及DNA測序后,將陽性重組子進行大量的培養(yǎng)擴增,抽提質粒,經Bln Ⅰ酶切線性化后電擊轉化進入表達載體巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,Pp)GS115中.轉化后在含抗生素Zeocin的低鹽YPDS培養(yǎng)基上進行平板篩選,獲得20個具有抗性的菌落,通過對這20個菌落表達上清進行Tricine-SDS-PAGE

2、篩選獲得高表達菌株1個.Tricine-SDS-PAGE結果顯示,陽性重組菌的表達產物較空白菌在3.0kD處有一條明顯的rCMTI Ⅰ條帶,占分泌蛋白總量的6.21%,表達量為609mg/L.采用親和分離技術對重組表達產物rCMTI Ⅰ進行了分離純化.首先制備了殼聚糖多孔珠,并以戊二醛為交聯(lián)劑將胰蛋白酶交聯(lián)于其上獲得了親和吸附劑,還考察了殼聚糖多孔珠以及殼聚糖多孔珠親和吸附劑的性質.然后用所制備的親和吸附劑采用靜態(tài)吸附和洗脫方式從含有表

3、達產物的培養(yǎng)基中直接分離純化rCMTI Ⅰ.最后通過Sephadex G-10層析對獲得的洗脫液冷凍干燥品進行脫鹽和進一步純化,獲得了基本純化的rCMTI Ⅰ.經Tricine-SDS-PAGE分析,純化rCMTI Ⅰ的分子量約為3.2kD,與文獻報道的CMTI Ⅰ的分子量一致.純化產物具有抑制胰蛋白酶活性的作用.本論文還對rCMTI Ⅰ的相關性質進行了研究.研究證明rCMTI Ⅰ為胰蛋白酶的非競爭性可逆性抑制劑,其抑制常數Ki為4.5